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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 融合蛋白在大肠杆菌中的表达，怎么被我越做越复杂了？
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rabbit9355

铁虫 (初入文坛)

[交流] 融合蛋白在大肠杆菌中的表达，怎么被我越做越复杂了？ 已有5人参与

刚入手做分子克隆的东西，导师给了个蛋白原核表达的实验，练练手。
        主要就是找个蛋白的序列，连接到PET21中，在大肠杆菌表达体系中进行表达，并且用His-tag进行纯化。全序列都是公司合成的，并且还帮我连到了pet21上。第一次老师带着做的，第二次自己做的，纯化后得到的结果也不错。可是后来自己又表达了几次，都挂不上镍住了。再后来，做着做着，蛋白竟然不表达了，感觉特别匪夷所思。不过每次都是可溶表达，我还是挺有安慰的。大家有没有碰到类似的情况啊，求建议。
        是不是我的原理没有搞清楚，但是感觉都是按照分子克隆上的操作进行的，而且每次自己不确定的都会问老师的。这个实验都做了半年了，越做越沮丧，蛋白的后续功能实验都还没进行呢。而且实验还是借别人的实验室做的，我都不好意思了。
        哎，什么时候能看到希望呢，过来人给点鼓励吧。
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1楼 2011-05-11 11:33:55
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liukgg

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
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1949stone(金币+2): 鼓励 2011-05-11 12:40:41
可以从菌株和质粒方面分析一下，特别是质粒方面，建议测序分析一下，还有就是表达条件的优化，慢慢来吧
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山水凤凰
2楼2011-05-11 11:37:27
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rabbit9355

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by liukgg at 2011-05-11 11:37:27:
可以从菌株和质粒方面分析一下，特别是质粒方面，建议测序分析一下，还有就是表达条件的优化，慢慢来吧

谢谢了。希望能快点做出来。
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3楼2011-05-11 12:59:02
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如来神掌

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看样子不是技术问题了 是操作问题 比如菌种错了 培养基 pH 诱导条件等等

找找原因再做 别一直重复 没意义
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生活就像直播,没有彩排的机会,不可能从新来过!所以必须把握好现在的每一个瞬间!
4楼2011-05-11 17:26:37
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rabbit9355

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 如来神掌 at 2011-05-11 17:26:37:
看样子不是技术问题了 是操作问题 比如菌种错了 培养基 pH 诱导条件等等

找找原因再做 别一直重复 没意义

又重新转化了，要是还不行，就提质粒看看吧。
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5楼2011-05-12 12:00:56
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如来神掌

捐助贵宾 (著名写手)
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引用回帖:
Originally posted by rabbit9355 at 2011-05-12 12:00:56:
又重新转化了，要是还不行，就提质粒看看吧。

补充一下：可以测个序
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生活就像直播,没有彩排的机会,不可能从新来过!所以必须把握好现在的每一个瞬间!
6楼2011-05-12 12:45:58
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lihuaannie

新虫 (初入文坛)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
建议测序，看histag是否还在，另外，纯化时的pH值也是需要注意的。
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7楼2011-05-24 15:40:53
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101202139

铜虫 (小有名气)
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西瓜(金币+3): 欢迎交流 2011-05-26 21:58:28
首先，蛋白不表达了，这就需要认真的摸索一下诱导条件，温度以及诱导剂的浓度；另一方面，蛋白挂不上镍柱了，在保证蛋白表达正常的前提下，摸索纯化条件，特别是咪唑浓度。
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8楼2011-05-26 20:05:05
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chenxiang29

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也出现了同样的问题，半年了没有进展了，请问你是怎么解决的呀？
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smile to the world
9楼2013-10-06 09:12:18
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