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rabbit9355

铁虫 (初入文坛)

[交流] 融合蛋白在大肠杆菌中的表达,怎么被我越做越复杂了? 已有5人参与

刚入手做分子克隆的东西,导师给了个蛋白原核表达的实验,练练手。
        主要就是找个蛋白的序列,连接到PET21中,在大肠杆菌表达体系中进行表达,并且用His-tag进行纯化。全序列都是公司合成的,并且还帮我连到了pet21上。第一次老师带着做的,第二次自己做的,纯化后得到的结果也不错。可是后来自己又表达了几次,都挂不上镍住了。再后来,做着做着,蛋白竟然不表达了,感觉特别匪夷所思。不过每次都是可溶表达,我还是挺有安慰的。大家有没有碰到类似的情况啊,求建议。
        是不是我的原理没有搞清楚,但是感觉都是按照分子克隆上的操作进行的,而且每次自己不确定的都会问老师的。这个实验都做了半年了,越做越沮丧,蛋白的后续功能实验都还没进行呢。而且实验还是借别人的实验室做的,我都不好意思了。
        哎,什么时候能看到希望呢,过来人给点鼓励吧。
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rabbit9355

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by liukgg at 2011-05-11 11:37:27:
可以从菌株和质粒方面分析一下,特别是质粒方面,建议测序分析一下,还有就是表达条件的优化,慢慢来吧

谢谢了。希望能快点做出来。
3楼2011-05-11 12:59:02
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liukgg

木虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-05-11 12:40:41
可以从菌株和质粒方面分析一下,特别是质粒方面,建议测序分析一下,还有就是表达条件的优化,慢慢来吧
山水凤凰
2楼2011-05-11 11:37:27
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如来神掌

捐助贵宾 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
看样子不是技术问题了 是操作问题 比如菌种错了 培养基 pH 诱导条件等等

找找原因再做 别一直重复 没意义
生活就像直播,没有彩排的机会,不可能从新来过!所以必须把握好现在的每一个瞬间!
4楼2011-05-11 17:26:37
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rabbit9355

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by 如来神掌 at 2011-05-11 17:26:37:
看样子不是技术问题了 是操作问题 比如菌种错了 培养基 pH 诱导条件等等

找找原因再做 别一直重复 没意义

又重新转化了,要是还不行,就提质粒看看吧。
5楼2011-05-12 12:00:56
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