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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】烟曲霉菌提取RNA
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li1977li

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】烟曲霉菌提取RNA 已有3人参与

想从烟曲霉中提RNA进行反转录，所在实验室由于缺乏液氮研磨条件，用的是上海生工的trizol试剂，取约100mg菌体加1ml trizol，用的塑料研磨小棒在冰上磨约10分钟成匀浆状再按操作加氯仿等，提了2次在管底均见白色沉淀，浓度为200 ug/ml 左右,260/280为1.9 ，但1%琼脂糖电泳120V，20min均未看到条带，请教大家是怎回事？另在无液氮研磨下如何破壁？液体摇菌在多长时间收集菌体？在此先谢了！
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1楼 2011-04-10 20:46:35
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
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OD值测得浓度挺高的了，跑胶看不到条带十有八九是跑胶过程中降解了。
可以把电泳槽的缓冲液倒掉，换成新的，再跑一次看看。200ug/ml的浓度，上样1ul足矣。跑5分钟就可以看结果了。需要的话再跑个5分钟就差不多了。
破壁的话，我们实验室用的是破碎仪，10多秒就可以搞定。
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2楼2011-04-10 22:01:27
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li1977li

金虫 (小有名气)
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Originally posted by 西瓜 at 2011-04-10 22:01:27:
OD值测得浓度挺高的了，跑胶看不到条带十有八九是跑胶过程中降解了。
可以把电泳槽的缓冲液倒掉，换成新的，再跑一次看看。200ug/ml的浓度，上样1ul足矣。跑5分钟就可以看结果了。需要的话再跑个5分钟就差不多了 ...

谢谢指导，我都上样101ul，电泳液是新的但电泳槽没经处理是跑DNA的，不知有多大影响。
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3楼2011-04-11 08:49:43
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西瓜

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Originally posted by li1977li at 2011-04-11 08:49:43:
谢谢指导，我都上样101ul，电泳液是新的但电泳槽没经处理是跑DNA的，不知有多大影响。

我以前有一次也用的DNA的槽，没跑出来，后来用新的电泳液洗了一次，再跑就看到了。有条件的话跑RNA的电泳槽最好专用。
先确定有没有RNA吧，跑个5分钟就看看，你上10ul都有2ug了，这么大的量，如果有的话，就算被降解也该看到拖尾的带的。

提RNA时，异丙醇沉淀之后看到白色沉淀，我个人认为肯定是提出来了的。
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4楼2011-04-11 09:11:59
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li1977li

金虫 (小有名气)
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Originally posted by 西瓜 at 2011-04-11 09:11:59:
我以前有一次也用的DNA的槽，没跑出来，后来用新的电泳液洗了一次，再跑就看到了。有条件的话跑RNA的电泳槽最好专用。
先确定有没有RNA吧，跑个5分钟就看看，你上10ul都有2ug了，这么大的量，如果有的话，就 ...

拖尾的带是好像看到但无法确定是否是所提的RNA降解啊，按照你指导的方法去做看看，有问题还得请教啊！
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5楼2011-04-11 09:32:00
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西瓜

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Originally posted by li1977li at 2011-04-11 09:32:00:
拖尾的带是好像看到但无法确定是否是所提的RNA降解啊，按照你指导的方法去做看看，有问题还得请教啊！

呵呵，客气了！RNA被降解，各种大小都有，所以有拖尾。下次上图来啊，这样更直观。
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6楼2011-04-11 09:43:40
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mxlo.o

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4楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-04-11 09:11:59:
我以前有一次也用的DNA的槽，没跑出来，后来用新的电泳液洗了一次，再跑就看到了。有条件的话跑RNA的电泳槽最好专用。
先确定有没有RNA吧，跑个5分钟就看看，你上10ul都有2ug了，这么大的量，如果有的话，就 ...

我现在也是提取一种霉菌的RNA，每次测得的OD值是在1.7到2.0之间，但是一跑胶就是不出带，而且我在提取过程中每次加入异丙醇之后就会有白色沉淀出现，但是这些沉淀在加入RNA溶解液之后不容。据我查的资料，有的说是蛋白质污染。想问一下为什么会出现这种现象，怎么解决~
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7楼2011-11-29 10:18:19
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西瓜

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7楼: Originally posted by mxlo.o at 2011-11-29 10:18:19:
我现在也是提取一种霉菌的RNA，每次测得的OD值是在1.7到2.0之间，但是一跑胶就是不出带，而且我在提取过程中每次加入异丙醇之后就会有白色沉淀出现，但是这些沉淀在加入RNA溶解液之后不容。据我查的资料，有的说 ...

加异丙醇后的白色沉淀就是RNA啊，没有沉淀才不正常。我提RNA，这个沉淀也是不能完全溶解，虽然最后提的量也不小。之前的帖子里，有人说是pH的原因导致不能完全溶，你可以搜搜看。
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8楼2011-11-29 10:31:45
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mxlo.o

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8楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-11-29 10:31:45:
加异丙醇后的白色沉淀就是RNA啊，没有沉淀才不正常。我提RNA，这个沉淀也是不能完全溶解，虽然最后提的量也不小。之前的帖子里，有人说是pH的原因导致不能完全溶，你可以搜搜看。

这样啊。我把它当成污染离心又除去了，反转录之后直接扩增不出来。
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9楼2011-11-29 10:40:23
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mxlo.o

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8楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-11-29 10:31:45:
加异丙醇后的白色沉淀就是RNA啊，没有沉淀才不正常。我提RNA，这个沉淀也是不能完全溶解，虽然最后提的量也不小。之前的帖子里，有人说是pH的原因导致不能完全溶，你可以搜搜看。

你说的有道理，但是我用的是专门的RNA溶解液啊，不同的物种RNA溶解应该是一样的吧
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10楼2011-11-29 10:44:27
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