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li1977li

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】烟曲霉菌提取RNA已有3人参与

想从烟曲霉中提RNA进行反转录,所在实验室由于缺乏液氮研磨条件,用的是上海生工的trizol试剂,取约100mg菌体加1ml trizol,用的塑料研磨小棒在冰上磨约10分钟成匀浆状再按操作加氯仿等,提了2次在管底均见白色沉淀,浓度为200 ug/ml 左右,260/280为1.9 ,但1%琼脂糖电泳120V,20min均未看到条带,请教大家是怎回事?另在无液氮研磨下如何破壁?液体摇菌在多长时间收集菌体?在此先谢了!
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
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7楼: Originally posted by mxlo.o at 2011-11-29 10:18:19:
我现在也是提取一种霉菌的RNA,每次测得的OD值是在1.7到2.0之间,但是一跑胶就是不出带,而且我在提取过程中每次加入异丙醇之后就会有白色沉淀出现,但是这些沉淀在加入RNA溶解液之后不容。据我查的资料,有的说 ...

加异丙醇后的白色沉淀就是RNA啊,没有沉淀才不正常。我提RNA,这个沉淀也是不能完全溶解,虽然最后提的量也不小。之前的帖子里,有人说是pH的原因导致不能完全溶,你可以搜搜看。
8楼2011-11-29 10:31:45
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
OD值测得浓度挺高的了,跑胶看不到条带十有八九是跑胶过程中降解了。
可以把电泳槽的缓冲液倒掉,换成新的,再跑一次看看。200ug/ml的浓度,上样1ul足矣。跑5分钟就可以看结果了。需要的话再跑个5分钟就差不多了。
破壁的话,我们实验室用的是破碎仪,10多秒就可以搞定。
2楼2011-04-10 22:01:27
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li1977li

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-10 22:01:27:
OD值测得浓度挺高的了,跑胶看不到条带十有八九是跑胶过程中降解了。
可以把电泳槽的缓冲液倒掉,换成新的,再跑一次看看。200ug/ml的浓度,上样1ul足矣。跑5分钟就可以看结果了。需要的话再跑个5分钟就差不多了 ...

谢谢指导,我都上样101ul,电泳液是新的但电泳槽没经处理是跑DNA的,不知有多大影响。
3楼2011-04-11 08:49:43
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
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Originally posted by li1977li at 2011-04-11 08:49:43:
谢谢指导,我都上样101ul,电泳液是新的但电泳槽没经处理是跑DNA的,不知有多大影响。

我以前有一次也用的DNA的槽,没跑出来,后来用新的电泳液洗了一次,再跑就看到了。有条件的话跑RNA的电泳槽最好专用。
先确定有没有RNA吧,跑个5分钟就看看,你上10ul都有2ug了,这么大的量,如果有的话,就算被降解也该看到拖尾的带的。

提RNA时,异丙醇沉淀之后看到白色沉淀,我个人认为肯定是提出来了的。
4楼2011-04-11 09:11:59
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