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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】pcr引物退火温度
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助】pcr引物退火温度

各位大侠，小弟最近在做PCR,扩出的目的条带及其微弱，但杂带较亮。引物为以下
上游ATCCACGAGTACCATCATCTATGACTCCTTTAACTTTAG
下游GGCCTCGAGCCGTTAATTTTGTTTGATTTCAGCAT
请求帮助分析原因，并且求具体的退火温度，谢谢

[ Last edited by xuqingchun33 on 2011-4-7 at 21:47 ]
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1楼2011-04-07 21:41:56
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forrestgump

新虫 (著名写手)
只能换引物了，不过也得看你的目的了
要是做表达尽快换，要是克隆弱点无所谓了。
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2楼2011-04-07 23:38:41
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
楼主这引物还真是长啊……不是普通的PCR吧？说详细点吧。
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3楼2011-04-07 23:52:42
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yabxxh

木虫 (正式写手)
请问你的PCR条件怎么样，前端TM66后端64，如果加了酶切位点，建议降低5度，5个循环，65度30个循环，没加酶切位点的话，直接65度30个循环，好运
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4楼2011-04-08 09:28:42
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)
可以尝试的方法：
1.适当添加一些PCR辅助物，如DMSO、BSA等等，具体的可以参考《分子克隆实验指南》
2.在现有的退火温度基础上逐步提高退火一下温度，看看产物情况；
3.差异温度
  前5-10循环可以适当提高退火温度到一个比较高的温度，比如你的Tm值，然后再接下来的退火温度恢复到正常的温度；
4.再不行，重新设计一对引物吧，设计引物后可以去做一下全基因组的引物Blast，看看引物的特异性如何
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5楼2011-04-08 09:49:36
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-07 23:52:42:
楼主这引物还真是长啊……不是普通的PCR吧？说详细点吧。

是重叠延伸PCR，上游是重叠引物
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6楼2011-04-08 10:26:09
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
xuqingchun33(金币+1): 2011-04-10 09:55:21
引用回帖:
Originally posted by xuqingchun33 at 2011-04-08 10:26:09:
是重叠延伸PCR，上游是重叠引物

重叠PCR产物微弱是很正常的，而且在引物优化上也没有太大的余地。我们一般会再做一次PCR,以第一次引物的产物为模板，第二次PCR的引物往里退10多bp（一般10bp以上，长点没关系），这样第二次PCR就能得到特异的产物了。这个貌似叫做巢式PCR吧。

当然，这样的话，设计第一对引物时就要往外延一些了。第一次PCR产物，取10ul跑胶，看到有目的条带就行，有杂带也没关系。然后取5ul作为模板进行第二次PCR。

重叠PCR其他问题也可以问我。

[ Last edited by 西瓜 on 2011-4-8 at 11:28 ]
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7楼2011-04-08 10:42:40
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by xuqingchun33 at 2011-04-07 21:41:56:
各位大侠，小弟最近在做PCR,扩出的目的条带及其微弱，但杂带较亮。引物为以下
上游ATCCACGAGTACCATCATCTATGACTCCTTTAACTTTAG
下游GGCCTCGAGCCGTTAATTTTGTTTGATTTCAGCAT
请求帮助分析原因，并且求具体的退火温度 ...

如果是做重叠PCR，那么你的这个是中间的重叠引物嘛，貌似没有设计好哦，这对引物该是完全互补这样好做写的。
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8楼2011-04-08 13:33:55
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-08 10:42:40:
重叠PCR产物微弱是很正常的，而且在引物优化上也没有太大的余地。我们一般会再做一次PCR,以第一次引物的产物为模板，第二次PCR的引物往里退10多bp（一般10bp以上，长点没关系），这样第二次PCR就能得到特异的 ...

重叠和巢式是不一样的哦~~~
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9楼2011-04-08 13:34:40
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by 睡着数绵羊 at 2011-04-08 13:34:40:
重叠和巢式是不一样的哦~~~

重叠+巢式
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10楼2011-04-08 14:58:17
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