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xuqingchun33

银虫 (小有名气)

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[交流] 【求助】pcr引物退火温度

各位大侠，小弟最近在做PCR,扩出的目的条带及其微弱，但杂带较亮。引物为以下
上游ATCCACGAGTACCATCATCTATGACTCCTTTAACTTTAG
下游GGCCTCGAGCCGTTAATTTTGTTTGATTTCAGCAT
请求帮助分析原因，并且求具体的退火温度，谢谢

[ Last edited by xuqingchun33 on 2011-4-7 at 21:47 ]

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1楼2011-04-07 21:41:56

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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

xuqingchun33(金币+1): 2011-04-10 09:55:21

引用回帖:

Originally posted by xuqingchun33 at 2011-04-08 10:26:09:
是重叠延伸PCR，上游是重叠引物

重叠PCR产物微弱是很正常的，而且在引物优化上也没有太大的余地。我们一般会再做一次PCR,以第一次引物的产物为模板，第二次PCR的引物往里退10多bp（一般10bp以上，长点没关系），这样第二次PCR就能得到特异的产物了。这个貌似叫做巢式PCR吧。

当然，这样的话，设计第一对引物时就要往外延一些了。第一次PCR产物，取10ul跑胶，看到有目的条带就行，有杂带也没关系。然后取5ul作为模板进行第二次PCR。

重叠PCR其他问题也可以问我。

[ Last edited by 西瓜 on 2011-4-8 at 11:28 ]