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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】pcr引物退火温度
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助】pcr引物退火温度

各位大侠，小弟最近在做PCR,扩出的目的条带及其微弱，但杂带较亮。引物为以下
上游ATCCACGAGTACCATCATCTATGACTCCTTTAACTTTAG
下游GGCCTCGAGCCGTTAATTTTGTTTGATTTCAGCAT
请求帮助分析原因，并且求具体的退火温度，谢谢

[ Last edited by xuqingchun33 on 2011-4-7 at 21:47 ]
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1楼 2011-04-07 21:41:56
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yabxxh

木虫 (正式写手)
请问你的PCR条件怎么样，前端TM66后端64，如果加了酶切位点，建议降低5度，5个循环，65度30个循环，没加酶切位点的话，直接65度30个循环，好运
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4楼2011-04-08 09:28:42
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forrestgump

新虫 (著名写手)
只能换引物了，不过也得看你的目的了
要是做表达尽快换，要是克隆弱点无所谓了。
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2楼2011-04-07 23:38:41
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
楼主这引物还真是长啊……不是普通的PCR吧？说详细点吧。
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3楼2011-04-07 23:52:42
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)
可以尝试的方法：
1.适当添加一些PCR辅助物，如DMSO、BSA等等，具体的可以参考《分子克隆实验指南》
2.在现有的退火温度基础上逐步提高退火一下温度，看看产物情况；
3.差异温度
  前5-10循环可以适当提高退火温度到一个比较高的温度，比如你的Tm值，然后再接下来的退火温度恢复到正常的温度；
4.再不行，重新设计一对引物吧，设计引物后可以去做一下全基因组的引物Blast，看看引物的特异性如何
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5楼2011-04-08 09:49:36
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