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xuqingchun33

银虫 (小有名气)

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虫号: 918005

[交流] 【求助】pcr引物退火温度

各位大侠，小弟最近在做PCR,扩出的目的条带及其微弱，但杂带较亮。引物为以下
上游ATCCACGAGTACCATCATCTATGACTCCTTTAACTTTAG
下游GGCCTCGAGCCGTTAATTTTGTTTGATTTCAGCAT
请求帮助分析原因，并且求具体的退火温度，谢谢

[ Last edited by xuqingchun33 on 2011-4-7 at 21:47 ]

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1楼2011-04-07 21:41:56

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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)

可以尝试的方法：
1.适当添加一些PCR辅助物，如DMSO、BSA等等，具体的可以参考《分子克隆实验指南》
2.在现有的退火温度基础上逐步提高退火一下温度，看看产物情况；
3.差异温度
前5-10循环可以适当提高退火温度到一个比较高的温度，比如你的Tm值，然后再接下来的退火温度恢复到正常的温度；
4.再不行，重新设计一对引物吧，设计引物后可以去做一下全基因组的引物Blast，看看引物的特异性如何