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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】western blot 缺带 断带
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ybh1987213

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】western blot 缺带 断带

最近做Western blot 出现了比较诡异的问题，一个流程下来，胶片的曝光结果上有个别条带断开，或者干脆就缺失，包括泳道背景也丢失了，就好像膜上有个大气泡一样。但是膜用立春红染后相当完整，我抗体孵育的时候杂交袋中的抗体工作液也相当充盈，肯定没有气泡，不知是什么原因导致的。
初步怀疑可能在底物显色的时候用玻璃棒赶发光也所致，不知道有没有道理，各位有没有什么好办法可以避免这样的悲剧。
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1楼 2011-04-02 14:58:46
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dreaming0816

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-04-04 08:33:28
如果是曝光的问题，可以改作DAB显色，凝胶成像系统拍照分析啊。
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2楼2011-04-03 17:10:50
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funking

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-04-04 08:33:39
转膜和孵抗体确定都没问题的话，基本上就是最后显色液的问题了   做个重复就清楚了
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3楼2011-04-03 22:56:14
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-04-06 18:33:30
可能会是转膜的时候在滤纸，什么的上面有残留气泡影响了蛋白质的转膜过程即残留有气泡的地方可能就没发生蛋白质转移
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4楼2011-04-05 17:38:21
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gyq625

新虫 (初入文坛)

求助指点

1949stone: 可以单独发帖子 会有帮助 2011-04-06 18:33:56
您好，我是研一学生，也开始学做分子生物学这块，但我们研究室刚做这块，技术基础和条件什么都没有，只能摸索啊。那个western 所用的燃料一般选用什么较好哇，是SYBR GREEN还是考马斯亮蓝或者别的？一般做western blot是用各种试剂自己做还是用western blot试剂盒好和划算啊？如果可以的话能恳请您发些western blot所需的相关药品和必备的技术条件设施的吗？？多谢多谢了。我的邮箱geyuqing625@163.com
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5楼2011-04-06 10:28:40
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sheryl99

金虫 (小有名气)
★
1949stone(金币+1): 鼓励 2011-04-06 18:34:06
可能是在显影定影的时候有小问题了，建议再做一遍，有时候就是有很奇怪的结果
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6楼2011-04-06 17:24:56
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ybh1987213

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by ybh1987213 at 2011-04-02 14:58:46:
最近做Western blot 出现了比较诡异的问题，一个流程下来，胶片的曝光结果上有个别条带断开，或者干脆就缺失，包括泳道背景也丢失了，就好像膜上有个大气泡一样。但是膜用立春红染后相当完整，我抗体孵育的时候杂 ...

这个真不行。。。DAB没那么灵敏，而且需要胶片支持
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7楼2011-04-07 10:18:24
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ybh1987213

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): 要加油啊，欢迎继续交流 2011-04-08 08:48:51
引用回帖:
Originally posted by dreaming0816 at 2011-04-03 17:10:50:
如果是曝光的问题，可以改作DAB显色，凝胶成像系统拍照分析啊。

不瞒你说，我还真做过整版只点一个样品的测试，结果有的时候确实重复性很好，有的时候重复性巨差，立春红染色后观察目的条带几乎都很均一，是在肉眼很难分辨，我对WB的实验重复性彻底失去信心了
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8楼2011-04-07 10:20:37
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ybh1987213

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by gyq625 at 2011-04-06 10:28:40:
您好，我是研一学生，也开始学做分子生物学这块，但我们研究室刚做这块，技术基础和条件什么都没有，只能摸索啊。那个western 所用的燃料一般选用什么较好哇，是SYBR GREEN还是考马斯亮蓝或者别的？一般做western ...

同感~WB有时候一些灵异事件实在解释不了~有时候不光是手法，还需要一定程度的运气。。。。
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9楼2011-04-07 10:23:14
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ybh1987213

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励新虫交流。显然您是高手^_^ 2011-04-10 19:21:33
引用回帖:
Originally posted by gyq625 at 2011-04-06 10:28:40:
您好，我是研一学生，也开始学做分子生物学这块，但我们研究室刚做这块，技术基础和条件什么都没有，只能摸索啊。那个western 所用的燃料一般选用什么较好哇，是SYBR GREEN还是考马斯亮蓝或者别的？一般做western ...

染胶就用考马斯亮蓝，染膜就用立春红，试剂什么的配方网上就有很多，大体都差不多，WB最关键的一点就是抗体抗体，抗体好闭眼睛都能做出来，如果新手的话建议你先拿内参抗体练手。差不多了再用实验样本，毕竟样本不好弄啊。
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10楼2011-04-07 10:27:43
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donghaiyu

木虫 (小有名气)
应该是显色的问题
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11楼2011-04-08 04:24:49
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ujsyangyong

铁杆木虫 (著名写手)
应该是最后发光的时候发光剂孵育不均匀，一般酶的活性能持续比较长时间，可以重新加发光剂扫描结果。
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13楼2011-04-10 11:52:08
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mamadexiao

木虫 (正式写手)
咋觉得是转膜的时候有气泡阿...
有可能气泡没赶干净
楼主在做次呗~~~
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14楼2011-04-10 11:55:41
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nirvana0724

木虫 (小有名气)
转膜和孵抗体确定都没问题的话，基本上就是最后显色液的问题了   做个重复就清楚了
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15楼2011-04-10 13:14:51
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75372017

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by ybh1987213 at 2011-04-07 10:27:43:
染胶就用考马斯亮蓝，染膜就用立春红，试剂什么的配方网上就有很多，大体都差不多，WB最关键的一点就是抗体抗体，抗体好闭眼睛都能做出来，如果新手的话建议你先拿内参抗体练手。差不多了再用实验样本，毕竟样本 ...

同感。。。不过内参练手没感觉，只要不拖尾，就能有漂亮的条带
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16楼2011-04-10 17:21:18
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yeyun0213

银虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-04-18 18:46:33
俺最近也是丽春红染色条带很好，可是敷完抗体就是拖带！！！！2次都是这样，也不是所有样都有拖带，不知道啥原因
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17楼2011-04-18 11:49:03
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ybh1987213

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by ujsyangyong at 2011-04-10 11:52:08:
应该是最后发光的时候发光剂孵育不均匀，一般酶的活性能持续比较长时间，可以重新加发光剂扫描结果。

要说不均匀那就只剩下膜上残留的水分的影响了，一般遇到此类情况我都会重新加的，有时灵有时不灵，很诡异
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18楼2011-04-24 15:19:52
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ybh1987213

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by mamadexiao at 2011-04-10 11:55:41:
咋觉得是转膜的时候有气泡阿...
有可能气泡没赶干净
楼主在做次呗~~~

恩恩，重做了~一般气泡用立春红染色都是能看见的，而且如果是气泡也太大了点。。。
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19楼2011-04-24 15:23:15
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ybh1987213

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by yeyun0213 at 2011-04-18 11:49:03:
俺最近也是丽春红染色条带很好，可是敷完抗体就是拖带！！！！2次都是这样，也不是所有样都有拖带，不知道啥原因

你说的这种情况我也遇到过，抗体在识别每个样品时有时候就是会出现不一样的带，有可能是蛋白有所降解，要么干脆就是个体差异，其实如果一个抗体的特异性好的话，出来的带型应该是差不多的，个人观点，仅供参考。
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20楼2011-04-24 15:27:24
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ybh1987213

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by nirvana0724 at 2011-04-10 13:14:51:
转膜和孵抗体确定都没问题的话，基本上就是最后显色液的问题了   做个重复就清楚了

不知道您指的重复是什么样的。
我个人觉得WB的重复性不是特别的好，我用同一个样品上了8次重复，出来的带都会有差异，这个差异有时候很小，有时候很大，人毕竟不是机器，试剂也不是只用那一批。。。WB这实验啊。。。变数太多了。
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21楼2011-04-24 15:30:18
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xuansufei

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本人最近也在做啊。同一条带上有的很明显有的就缺失或者就没有。
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22楼2012-09-05 10:35:47
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zyxme12楼
2011-04-08 07:08   回复  
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