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jeck.li

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[交流] 【求助/交流】启动子给怎么弄---大肠杆菌做表达宿主已有2人参与

各位大虾好！
我要表达一个33kb的片段，需要在前面加一个T7启动子（通过同源重组--RED重组），为了验证启动子是否加上，需要在启动子附近加个抗性标记。实在不知道给怎么办？
应该是以下哪个顺序：
启动子--抗性基因--启动子--目的基因？

启动子--抗性基因--目的基因？

谢谢

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1楼 2011-03-30 10:27:46

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zhaohq1209

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引用回帖:

Originally posted by jeck.li at 2011-03-30 10:27:46:
各位大虾好！
我要表达一个33kb的片段，需要在前面加一个T7启动子（通过同源重组--RED重组），为了验证启动子是否加上，需要在启动子附近加个抗性标记。实在不知道给怎么办？
应该是以下哪个顺序：
启动子--抗 ...

看lz的意思是要在33kb基因的前面加T7启动子。

同时加入抗性标记的目的应该不是验证启动子是否加上，而是作为报告基因进行筛
选。

个人认为顺序可以是抗性基因-启动子-目的基因。理由如下：

1、启动子肯定在目的基因之前；

2、理论上抗性基因与启动子的位置可以随意，但二者应该相邻，否则失去筛选的意义。若抗性基因在启动子之后有可能会影响启动子之后目的基因的表达，比如发生移码突变等。

3、抗性基因在启动子之前可能会导致表达量低，但不用担心无法筛选。我曾经在基因注释的非编码区插入一个kan抗性基因，能筛选出来。

另外，据文献报道，插入的抗性基因一般为kan或cm。

祝lz好运。