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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助/交流】his标签蛋白纯化
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】his标签蛋白纯化

最近在做几种蛋白的纯化，咪唑浓度在调整，但是在目的蛋白的上面总是出现同样大小的非特异性条带，浓度不是很高，是不是可能是菌体蛋白呢？如何除去这个杂带呢？请高人支招。
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1楼 2011-03-30 08:43:12
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gppwfh

金虫 (正式写手)
★ ★
lstt09nk(金币+2): 有道理 2011-03-30 09:49:32
dianaofyezi(金币+1): 谢谢你中肯的意见。后续实验中要求蛋白纯度比较高，还是要去除杂带才行哦。 2011-03-30 11:51:06
只做一次his纯化，不一定能把所有杂带除去。有可能是杂带具有相似的his结构，也同样结合到纯化柱上了。 建议先做个WB看看，如果不影响目的蛋白活性及后续实验，其实也不用全部去除杂带的。
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2楼2011-03-30 08:53:06
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qjy_134

铜虫 (小有名气)
楼主纯化出来的蛋白后续做什么实验
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3楼2011-03-30 15:06:41
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by qjy_134 at 2011-03-30 15:06:41:
楼主纯化出来的蛋白后续做什么实验

要先切除his标签，然后测定蛋白活力，然后还要上细胞。
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4楼2011-03-30 15:41:12
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
dianaofyezi(金币+2): 谢谢你的指点，理论上感觉可行。 2011-03-30 18:15:19
lstt09nk(金币+1): 感谢参与 2011-04-28 13:44:29
切除标签之后再过一次Ni-NTA，反穿出来的就是你的目的蛋白，挂柱的是杂蛋白。
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5楼2011-03-30 15:52:49
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jasco

木虫 (正式写手)
dianaofyezi(金币+1): 谢谢！ 2011-03-31 10:44:58
5楼正解，切后上柱再收流穿就行了
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6楼2011-03-30 16:26:15
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夜雨再来

木虫 (小有名气)
楼主问一下，这种技术吸附蛋白的话，是不是很容易脱落？
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7楼2011-03-30 16:39:59
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 夜雨再来 at 2011-03-30 16:39:59:
楼主问一下，这种技术吸附蛋白的话，是不是很容易脱落？

没有明白啥意思？你是指配基容易脱落还是待纯化的蛋白呢？
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8楼2011-03-30 18:16:06
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
不知道有没有纯化方面的修改意见呢？
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9楼2011-03-31 08:24:39
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xuguanghai

木虫 (职业作家)
★
dianaofyezi(金币+1): 谢谢中肯的意见。 2011-03-31 08:42:55
lstt09nk(金币+1): 感谢参与 2011-04-28 13:44:53
加一点triton 100吧，洗杂的时候
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10楼2011-03-31 08:28:44
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
dianaofyezi(金币+1): 谢谢你的建议！我尝试看看。 2011-03-31 10:40:41
lstt09nk(金币+3): 热心 2011-04-28 13:45:24
单独的亲和层析很难获得纯度很高的蛋白。

不过就你现在的状态可以给你个建议：直接用蛋白酶柱上切除标签，只有目的蛋白可以掉下来。你平常咪唑洗脱的杂蛋白没有切点，就留在柱子上了。如果做的好了能极大提高蛋白的纯度！！！
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11楼2011-03-31 09:49:47
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liuyang1986

金虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
请问楼主切除组氨酸标签用什么酶啊？
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12楼2011-04-27 15:47:38
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dianaofyezi13楼
2011-04-27 21:42   回复  
Xa
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