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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】为什么我的PCR产物总是连接不上T载体
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猫咪胖胖

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】为什么我的PCR产物总是连接不上T载体 已有21人参与

我PCR回收得到的片段，与T载体连接后转化摇菌提质粒后可以P出目的条带，但测序总显示是空载体，不知道怎么回事。
PMD-18T和T1-simple都试过。
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1楼 2011-02-13 22:23:25
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
恩，酶切验证最可靠。
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Thank-you，so-blue.
3楼2011-02-14 08:45:03
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yguang

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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dhd997(金币+2): 谢谢交流 2011-02-17 11:10:24
你用的什么Taq酶，有些酶是不加A的，自然就连不上T载体了，另外你的T载体是新的吗，有些T载体反复冻融后连接效果会很差。
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7楼2011-02-17 09:04:00
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phoenix211

金虫 (小有名气)
酶切验证做了吗
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2楼2011-02-13 23:49:26
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+5): 谢谢交流 2011-02-14 10:25:15
酶切一下，如果切不对，说明你前面酶切的酶有核酸外切酶活性，连接之前的那次酶切就少了几个碱基了，这可能是原因之一，用纯一点的酶。
另外，菌P能出结果不一定就是对的，PCR这东西很难说的，有一点点都能扩增出来，说明不了啥太多的问题。
还有可能是连接的时候手法操作有问题，换个人连接试试看，生物实验这东西有时候是挺邪门的，或者回去睡上三天大觉，回来就都出来了。
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4楼2011-02-14 09:59:41
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
★
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PCR产物去测序啊，还能提高保密性，多好啊。。
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5楼2011-02-14 14:01:08
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猫咪胖胖

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): 鼓励新虫交流 2011-02-17 11:10:14
测序公司都说没连上，还有必要酶切吗？
我连了好几次都是这样，按理说T载体的连接效率不是很高吗？
唉，不懂啊，是不是我P的有问题。。。
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6楼2011-02-16 15:50:14
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张力民1598

铜虫 (小有名气)
同意楼上
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8楼2011-02-17 09:16:11
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★ ★
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dhd997(金币+1): 加油，欢迎交流 2011-02-17 11:10:41
最近我做的实验也是这样。总觉得T克隆时好时坏，明明好好的东西，第二天就什么都做不出来了
PCR比女人还反复无常
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你的日子如何，你的力量也必如何！
9楼2011-02-17 09:47:39
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yesonghua

金虫 (小有名气)
酶切验证一下吧
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10楼2011-02-17 10:31:14
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