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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】为什么我的PCR产物总是连接不上T载体
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猫咪胖胖

新虫 (初入文坛)

Taq酶就是普通的酶，T载体新的旧的都用过。
P出来了 回收到了 就应该能连上啊。。。
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11楼2011-02-19 20:50:21
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)

自由人，我型我秀！

优秀版主
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Originally posted by 猫咪胖胖 at 2011-02-19 12:50:21:
Taq酶就是普通的酶，T载体新的旧的都用过。
P出来了 回收到了 就应该能连上啊。。。

可以回复引用一下。想让谁回答？
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人生不过几十年，成败荣辱都在天，是非恩怨莫在意，健康快乐最值钱，自古人间苦无边，看得高远境如仙，愿你不为凡事恼，轻松快乐每一天。
12楼2011-02-19 21:01:04
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★
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是不是PCR产物有问题或是载体放的时间过长了？
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jiayoubashaonian
13楼2011-02-19 21:10:13
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猫咪胖胖

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by blackrose8089 at 2011-02-19 21:10:13:
是不是PCR产物有问题或是载体放的时间过长了？

不是，新的旧的都用过。
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14楼2011-03-16 22:54:37
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猫咪胖胖

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 猫咪胖胖 at 2011-03-16 22:54:37:
不是，新的旧的都用过。

我觉得可能是产物的问题，但是不知道问题在哪
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15楼2011-03-16 22:56:41
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔
★
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我每次都是先挑菌摇菌做菌液PCR,选择有目的条带的提质粒酶切,然后再选择测序,虽然有点麻烦，但避免了楼主遇到的问题
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一直向前！
16楼2011-03-16 23:07:13
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poog502

木虫 (正式写手)
★
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PMD-18 T载体效率低，用用pGEM-T载体效率极高
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17楼2011-03-16 23:14:39
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zhangby2002

银虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
Originally posted by 猫咪胖胖 at 2011-02-13 22:23:25:
我PCR回收得到的片段，与T载体连接后转化摇菌提质粒后可以P出目的条带，但测序总显示是空载体，不知道怎么回事。
PMD-18T和T1-simple都试过。

我和你的问题一样呀~也比较郁闷！我也做啦双酶切鉴定啦
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业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。
18楼2011-03-19 17:31:56
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zhangby2002

银虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
Originally posted by zhangxn2010 at 2011-03-16 23:07:13:
我每次都是先挑菌摇菌做菌液PCR,选择有目的条带的提质粒酶切,然后再选择测序,虽然有点麻烦，但避免了楼主遇到的问题

我和你的程序一样呀，做啦双酶切，用的载体是PMD18-T,送测序公司，说没信号或者出现套峰，结果不好。
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业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。
19楼2011-03-19 17:34:10
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taigongzaici

新虫 (小有名气)
★
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1.搞清楚你的载体是否有问题
2.TA连接是常规实验，应该很好做。TAKARA的18，19都没问题，效率很高
3.建议用M13-47和48做菌液PCR检测，看看到底有无片段插入（酶切也可以）
4.换个测序公司试试看
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20楼2011-03-19 20:13:19
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