【求助/交流】为什么我的PCR产物总是连接不上T载体 - 分子生物 - 综合其他

11楼2011-02-19 20:50:21

dhd997

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Originally posted by 猫咪胖胖 at 2011-02-19 12:50:21:
Taq酶就是普通的酶，T载体新的旧的都用过。
P出来了回收到了就应该能连上啊。。。

可以回复引用一下

。想让谁回答？

人生不过几十年，成败荣辱都在天，是非恩怨莫在意，健康快乐最值钱，自古人间苦无边，看得高远境如仙，愿你不为凡事恼，轻松快乐每一天。

12楼2011-02-19 21:01:04

blackrose8089

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是不是PCR产物有问题或是载体放的时间过长了？

jiayoubashaonian

13楼2011-02-19 21:10:13

猫咪胖胖

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Originally posted by blackrose8089 at 2011-02-19 21:10:13:
是不是PCR产物有问题或是载体放的时间过长了？

不是，新的旧的都用过。

赞一下

14楼2011-03-16 22:54:37

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Originally posted by 猫咪胖胖 at 2011-03-16 22:54:37:
不是，新的旧的都用过。

我觉得可能是产物的问题，但是不知道问题在哪

赞一下

15楼2011-03-16 22:56:41

zhangxn2010

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我每次都是先挑菌摇菌做菌液PCR,选择有目的条带的提质粒酶切,然后再选择测序,虽然有点麻烦，但避免了楼主遇到的问题

一直向前！

16楼2011-03-16 23:07:13

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PMD-18 T载体效率低，用用pGEM-T载体效率极高

17楼2011-03-16 23:14:39

zhangby2002

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Originally posted by 猫咪胖胖 at 2011-02-13 22:23:25:
我PCR回收得到的片段，与T载体连接后转化摇菌提质粒后可以P出目的条带，但测序总显示是空载体，不知道怎么回事。
PMD-18T和T1-simple都试过。

我和你的问题一样呀~也比较郁闷！我也做啦双酶切鉴定啦

业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。

18楼2011-03-19 17:31:56

zhangby2002

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Originally posted by zhangxn2010 at 2011-03-16 23:07:13:
我每次都是先挑菌摇菌做菌液PCR,选择有目的条带的提质粒酶切,然后再选择测序,虽然有点麻烦，但避免了楼主遇到的问题

我和你的程序一样呀，做啦双酶切，用的载体是PMD18-T,送测序公司，说没信号或者出现套峰，结果不好。

业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。

19楼2011-03-19 17:34:10

taigongzaici

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1.搞清楚你的载体是否有问题
2.TA连接是常规实验，应该很好做。TAKARA的18，19都没问题，效率很高
3.建议用M13-47和48做菌液PCR检测，看看到底有无片段插入（酶切也可以）
4.换个测序公司试试看

20楼2011-03-19 20:13:19