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猫咪胖胖

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】为什么我的PCR产物总是连接不上T载体 已有21人参与

我PCR回收得到的片段,与T载体连接后转化摇菌提质粒后可以P出目的条带,但测序总显示是空载体,不知道怎么回事。
PMD-18T和T1-simple都试过。
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yguang

木虫 (职业作家)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
dhd997(金币+2): 谢谢交流 2011-02-17 11:10:24
你用的什么Taq酶,有些酶是不加A的,自然就连不上T载体了,另外你的T载体是新的吗,有些T载体反复冻融后连接效果会很差。
7楼2011-02-17 09:04:00
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

恩,酶切验证最可靠。
Thank-you,so-blue.
3楼2011-02-14 08:45:03
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amilie030312

金虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
dhd997(金币+5): 谢谢交流 2011-02-14 10:25:15
酶切一下,如果切不对,说明你前面酶切的酶有核酸外切酶活性,连接之前的那次酶切就少了几个碱基了,这可能是原因之一,用纯一点的酶。
另外,菌P能出结果不一定就是对的,PCR这东西很难说的,有一点点都能扩增出来,说明不了啥太多的问题。
还有可能是连接的时候手法操作有问题,换个人连接试试看,生物实验这东西有时候是挺邪门的,或者回去睡上三天大觉,回来就都出来了。
4楼2011-02-14 09:59:41
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
PCR产物去测序啊,还能提高保密性,多好啊。。
5楼2011-02-14 14:01:08
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