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乱马123

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】xho1单酶切,总连不上(片段3K,载体5K)已有6人参与

由于目的片段的限制,只能单酶切。
片段3K,载体5K,用NEB的T4连接酶,10ul体系中加1ul酶,载体:片段=1:10。
16度连接过夜。连过很多次,总是长出很多菌落(多为载体自连),挑菌做pcr,没有条带。
到底是哪里的问题,还请各位帮忙!先谢谢了!
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
最爱花诗雨(金币+1):正解~ 2011-01-07 13:07:42
单酶切之后为何不做载体去磷酸化?
2楼2011-01-07 11:58:29
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alexguo221

金虫 (初入文坛)

载体先去磷酸化
世道再难,也要呼吸顺畅。
3楼2011-01-07 12:49:46
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alexguo221

金虫 (初入文坛)

载体先去磷酸化
世道再难,也要呼吸顺畅。
4楼2011-01-07 12:50:21
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

★ ★
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amisking(金币+1):鼓励交流。 2011-01-07 22:57:30
载体没有必要去磷酸化吧,你可以在体系里多加一些载体进去!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-01-07 13:40:16
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乱马123

新虫 (初入文坛)

谢谢各位了,貌似去磷酸化很麻烦的,
是否要改变片段和载体的摩尔比?片段多加一些,以增加和载体连接的几率
6楼2011-01-07 18:08:19
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rainwander

铁杆木虫 (知名作家)

优秀版主

★ ★
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amisking(金币+1):鼓励交流。 2011-01-07 22:57:43
引用回帖:
Originally posted by 乱马123 at 2011-01-07 18:08:19:
谢谢各位了,貌似去磷酸化很麻烦的,
是否要改变片段和载体的摩尔比?片段多加一些,以增加和载体连接的几率

如果要去磷酸化的话,有磷酸化试剂盒,比较便宜

还有,我觉得,加入的比例可以改为1:3
千万不要因为走的太久,而忘记了我们为什么出发~~~~~~ForDream~~~~~~
7楼2011-01-07 20:59:16
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2):good! 2011-01-07 22:57:51
引用回帖:
Originally posted by 乱马123 at 2011-01-07 18:08:19:
谢谢各位了,貌似去磷酸化很麻烦的,
是否要改变片段和载体的摩尔比?片段多加一些,以增加和载体连接的几率

载体去磷酸化一点都不麻烦,不就还是一个酶和底物反应的过程
就算改变了连接比例,还是有自连出现
到时候你一个个去做菌落PCR鉴定还是坑爹啊
我现在做短基因合成和连接,只需挑一个克隆测序,克隆了二十几个到目前为止100%成功。我只要保证载体彻底酶切就可以了,长出来铁定是阳性克隆。
8楼2011-01-07 22:44:02
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匿名

用户注销 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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9楼2012-06-19 16:31:49
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