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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】xho1单酶切，总连不上(片段3K,载体5K)
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乱马123

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】xho1单酶切，总连不上(片段3K,载体5K) 已有6人参与

由于目的片段的限制，只能单酶切。
片段3K，载体5K,用NEB的T4连接酶，10ul体系中加1ul酶，载体：片段=1:10。
16度连接过夜。连过很多次，总是长出很多菌落（多为载体自连），挑菌做pcr,没有条带。
到底是哪里的问题，还请各位帮忙！先谢谢了！
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1楼 2011-01-07 11:33:36
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2):good！ 2011-01-07 22:57:51
引用回帖:
Originally posted by 乱马123 at 2011-01-07 18:08:19:
谢谢各位了，貌似去磷酸化很麻烦的，
是否要改变片段和载体的摩尔比？片段多加一些，以增加和载体连接的几率

载体去磷酸化一点都不麻烦，不就还是一个酶和底物反应的过程
就算改变了连接比例，还是有自连出现
到时候你一个个去做菌落PCR鉴定还是坑爹啊
我现在做短基因合成和连接，只需挑一个克隆测序，克隆了二十几个到目前为止100%成功。我只要保证载体彻底酶切就可以了，长出来铁定是阳性克隆。
赞一下(3人) 回复此楼
8楼2011-01-07 22:44:02
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
最爱花诗雨(金币+1):正解~ 2011-01-07 13:07:42
单酶切之后为何不做载体去磷酸化？
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2011-01-07 11:58:29
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1):鼓励交流。 2011-01-07 22:57:30
载体没有必要去磷酸化吧，你可以在体系里多加一些载体进去！
赞一下(2人) 回复此楼
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-01-07 13:40:16
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乱马123

新虫 (初入文坛)
谢谢各位了，貌似去磷酸化很麻烦的，
是否要改变片段和载体的摩尔比？片段多加一些，以增加和载体连接的几率
赞一下 回复此楼
6楼2011-01-07 18:08:19
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