应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】xho1单酶切，总连不上(片段3K,载体5K)
91/1返回列表
查看: 2303  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

乱马123

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】xho1单酶切，总连不上(片段3K,载体5K) 已有6人参与

由于目的片段的限制，只能单酶切。
片段3K，载体5K,用NEB的T4连接酶，10ul体系中加1ul酶，载体：片段=1:10。
16度连接过夜。连过很多次，总是长出很多菌落（多为载体自连），挑菌做pcr,没有条带。
到底是哪里的问题，还请各位帮忙！先谢谢了！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-01-07 11:33:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
最爱花诗雨(金币+1):正解~ 2011-01-07 13:07:42
单酶切之后为何不做载体去磷酸化？
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2011-01-07 11:58:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

alexguo221

金虫 (初入文坛)
载体先去磷酸化
回复此楼
世道再难，也要呼吸顺畅。
3楼2011-01-07 12:49:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

alexguo221

金虫 (初入文坛)
载体先去磷酸化
回复此楼
世道再难，也要呼吸顺畅。
4楼2011-01-07 12:50:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1):鼓励交流。 2011-01-07 22:57:30
载体没有必要去磷酸化吧，你可以在体系里多加一些载体进去！
赞一下(2人) 回复此楼
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-01-07 13:40:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

乱马123

新虫 (初入文坛)
谢谢各位了，貌似去磷酸化很麻烦的，
是否要改变片段和载体的摩尔比？片段多加一些，以增加和载体连接的几率
赞一下 回复此楼
6楼2011-01-07 18:08:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rainwander

铁杆木虫 (知名作家)

优秀版主
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1):鼓励交流。 2011-01-07 22:57:43
引用回帖:
Originally posted by 乱马123 at 2011-01-07 18:08:19:
谢谢各位了，貌似去磷酸化很麻烦的，
是否要改变片段和载体的摩尔比？片段多加一些，以增加和载体连接的几率

如果要去磷酸化的话，有磷酸化试剂盒，比较便宜

还有，我觉得，加入的比例可以改为1:3
赞一下(2人) 回复此楼
千万不要因为走的太久，而忘记了我们为什么出发~~~~~~ForDream~~~~~~
7楼2011-01-07 20:59:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2):good！ 2011-01-07 22:57:51
引用回帖:
Originally posted by 乱马123 at 2011-01-07 18:08:19:
谢谢各位了，貌似去磷酸化很麻烦的，
是否要改变片段和载体的摩尔比？片段多加一些，以增加和载体连接的几率

载体去磷酸化一点都不麻烦，不就还是一个酶和底物反应的过程
就算改变了连接比例，还是有自连出现
到时候你一个个去做菌落PCR鉴定还是坑爹啊
我现在做短基因合成和连接，只需挑一个克隆测序，克隆了二十几个到目前为止100%成功。我只要保证载体彻底酶切就可以了，长出来铁定是阳性克隆。
赞一下(3人) 回复此楼
8楼2011-01-07 22:44:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖仅楼主可见
赞一下
9楼2012-06-19 16:31:49
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页
相关版块跳转 我要订阅楼主 乱马123 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 2rKfVQg2jQww 2026-11-06 4/200 2026-11-07 10:14 by byEJ59EAM6hR
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 2rKfVQg2jQww 2026-11-06 4/200 2026-11-07 10:03 by byEJ59EAM6hR
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 5/250 2026-11-07 08:24 by byEJ59EAM6hR
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +10 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 22/1100 2026-11-06 17:18 by 5sJFDKp2kwuI
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 14/700 2026-11-06 16:32 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 11/550 2026-11-06 16:32 by 5sJFDKp2kwuI
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:23 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:12 by 5sJFDKp2kwuI
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 11/550 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +7 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 14/700 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +7 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 17/850 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +8 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +8 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 18/900 2026-11-06 13:36 by BkA9Bi5cMhkD
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 10/500 2026-11-06 05:32 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 14/700 2026-11-06 05:11 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 kvewwGtKktqB 2026-11-04 11/550 2026-11-06 05:10 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 14/700 2026-11-06 05:10 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 8/400 2026-11-06 02:24 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 hNpp4Y2CGvSC 2026-11-04 12/600 2026-11-06 01:53 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 10/500 2026-11-06 01:51 by qL1cU46YIdK0
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭