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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】荧光定量pcr求助
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lianyi1989

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】荧光定量pcr求助

最近刚刚做荧光定量，但是结果总是不好，有一点就是老达不到平台期，已经40个循环了，模板量已经加到2ul(20ul体系)，但还是不行，不知道是为什么，达不到平台期出来模板量低不知道还有没有其他原因？请各位能帮忙分析下，谢了！
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1楼 2010-12-23 14:58:18
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love_st

金虫 (著名写手)
lianyi1989(金币+1): 2010-12-23 19:33:35
上图呗，还有，为什么非得到平台，只要有平台的趋势就可以了
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2楼2010-12-23 16:52:56
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在雨中

金虫 (著名写手)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2010-12-23 18:54:35
lianyi1989(金币+1): 2010-12-23 19:33:40
我曾经碰到过类似的问题。
如果你的模板没有问题的话，是不是可以考虑下你的PCR mix的质量。
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3楼2010-12-23 18:28:23
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lianyi1989

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by love_st at 2010-12-23 16:52:56:
上图呗，还有，为什么非得到平台，只要有平台的趋势就可以了

就是到最后指数期还没完呢~这结果肯定没法用啊
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4楼2010-12-23 19:33:25
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sutao1979

木虫 (著名写手)
★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-12-23 23:31:15
lianyi1989(金币+1): 2010-12-25 11:07:13
这种情况和cDNA的quality有很大的关系，先看看你的reference gene怎么样？如果也是ct 的value很高的话，或者没有，那一定是cDNA的问题
qcpr两个因素很重要1：cDNA quality2：primer，可以从melting curve判断
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5楼2010-12-23 20:28:58
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
样品的浓度不够吧
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7楼2010-12-23 22:09:31
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lovenlong

铜虫 (小有名气)

好似你的体系有问题哦！

lianyi1989(金币+1): 2010-12-28 10:56:23
1.楼主的体系用的模板量是多少？各个反应管是否一致?按照标准的PCR体系来配，同时结合你用的试剂说明书来配体系，一般不会有太大问题。我做的10微升的体系一般10~30ng的模板就够了。
2.达不到平台期，有时候很难讲清楚原因的。可能你同样的体系有时能行有时又不行，细节不好把握。我上个月58度退火做得很好，昨天就不行了，今天换57度退火做了两次，第二次才行，不知道为啥。
3.最好是先做个梯度摸一摸退火温度，不然就来个Touch Down吧。个人感觉退火温度经常是没P好的主要原因。至于镁离子什么的定量可以少去考虑。
4.先配反应母液再分装，做三个以上重复测试体系可能会对你的实验有好处，特别是你以后做着做着老出问题的时候很烦的。

补充：如果PCR达不到平台期，定量结果很难看的，基本上没用。。。

[ Last edited by lovenlong on 2010-12-27 at 14:37 ]
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8楼2010-12-27 14:36:22
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lianyi1989

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lovenlong at 2010-12-27 14:36:22:
1.楼主的体系用的模板量是多少？各个反应管是否一致?按照标准的PCR体系来配，同时结合你用的试剂说明书来配体系，一般不会有太大问题。我做的10微升的体系一般10~30ng的模板就够了。
2.达不到平台期，有时候很难 ...

谢谢~我体系基本是按试剂说明书来配的，就是加大了模板的量而已，退火温度我是做普通pcr提前摸好的，感觉问题应该不大，上面有同学说可能是模板质量有问题，我现在就在怀疑是不是真是我模板质量的问题...据你做的经验，有没有可能是这种原因呢？
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9楼2010-12-28 11:11:02
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杨芷

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我做的荧光定量也是这种问题，我做的是白细胞介素2的表达量，引物换了几个都不太行，各位大仙有做过的，帮忙指点下，感激不尽。在线等候
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10楼2013-04-13 13:58:39
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-22 08:57:41
我觉还是应该从PCR的专一性不够角度找原因，尤其是引物的设计。
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11楼2013-04-16 23:38:32
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xanxus18

新虫 (初入文坛)
样品浓度不够
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12楼2013-04-21 20:51:10
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简单回复
dashu-973326楼
2010-12-23 21:04   回复  
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