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lianyi1989

金虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】荧光定量pcr求助

最近刚刚做荧光定量，但是结果总是不好，有一点就是老达不到平台期，已经40个循环了，模板量已经加到2ul(20ul体系)，但还是不行，不知道是为什么，达不到平台期出来模板量低不知道还有没有其他原因？请各位能帮忙分析下，谢了！

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1楼 2010-12-23 14:58:18

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lovenlong

铜虫 (小有名气)

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好似你的体系有问题哦！

lianyi1989(金币+1): 2010-12-28 10:56:23

1.楼主的体系用的模板量是多少？各个反应管是否一致?按照标准的PCR体系来配，同时结合你用的试剂说明书来配体系，一般不会有太大问题。我做的10微升的体系一般10~30ng的模板就够了。
2.达不到平台期，有时候很难讲清楚原因的。可能你同样的体系有时能行有时又不行，细节不好把握。我上个月58度退火做得很好，昨天就不行了，今天换57度退火做了两次，第二次才行，不知道为啥。
3.最好是先做个梯度摸一摸退火温度，不然就来个Touch Down吧。个人感觉退火温度经常是没P好的主要原因。至于镁离子什么的定量可以少去考虑。
4.先配反应母液再分装，做三个以上重复测试体系可能会对你的实验有好处，特别是你以后做着做着老出问题的时候很烦的。

补充：如果PCR达不到平台期，定量结果很难看的，基本上没用。。。