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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】荧光定量pcr求助
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lianyi1989

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】荧光定量pcr求助

最近刚刚做荧光定量，但是结果总是不好，有一点就是老达不到平台期，已经40个循环了，模板量已经加到2ul(20ul体系)，但还是不行，不知道是为什么，达不到平台期出来模板量低不知道还有没有其他原因？请各位能帮忙分析下，谢了！
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1楼2010-12-23 14:58:18
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lovenlong

铜虫 (小有名气)

好似你的体系有问题哦！

lianyi1989(金币+1): 2010-12-28 10:56:23
1.楼主的体系用的模板量是多少？各个反应管是否一致?按照标准的PCR体系来配，同时结合你用的试剂说明书来配体系，一般不会有太大问题。我做的10微升的体系一般10~30ng的模板就够了。
2.达不到平台期，有时候很难讲清楚原因的。可能你同样的体系有时能行有时又不行，细节不好把握。我上个月58度退火做得很好，昨天就不行了，今天换57度退火做了两次，第二次才行，不知道为啥。
3.最好是先做个梯度摸一摸退火温度，不然就来个Touch Down吧。个人感觉退火温度经常是没P好的主要原因。至于镁离子什么的定量可以少去考虑。
4.先配反应母液再分装，做三个以上重复测试体系可能会对你的实验有好处，特别是你以后做着做着老出问题的时候很烦的。

补充：如果PCR达不到平台期，定量结果很难看的，基本上没用。。。

[ Last edited by lovenlong on 2010-12-27 at 14:37 ]
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8楼2010-12-27 14:36:22
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love_st

金虫 (著名写手)
lianyi1989(金币+1): 2010-12-23 19:33:35
上图呗，还有，为什么非得到平台，只要有平台的趋势就可以了
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2楼2010-12-23 16:52:56
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在雨中

金虫 (著名写手)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2010-12-23 18:54:35
lianyi1989(金币+1): 2010-12-23 19:33:40
我曾经碰到过类似的问题。
如果你的模板没有问题的话，是不是可以考虑下你的PCR mix的质量。
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3楼2010-12-23 18:28:23
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lianyi1989

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by love_st at 2010-12-23 16:52:56:
上图呗，还有，为什么非得到平台，只要有平台的趋势就可以了

就是到最后指数期还没完呢~这结果肯定没法用啊
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4楼2010-12-23 19:33:25
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dashu-973326楼
2010-12-23 21:04   回复  
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