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jlulin

新虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助/交流】【求助】In-Fusion® Advantage PCR Cloning Kit克隆已有1人参与

大家好，我现在做用In-Fusion® Advantage PCR Cloning Kit克隆，很头疼，怎么都长不出来啊，纠结啊，大侠们帮帮忙啊！！！我的insert和vector由于在需要的地方都没有酶切位点，所以用是用pcr方法扩增出来的，然后用dpnⅠ37度一小时切除模板，再跑胶回收。插入片段较大，有5.5k，载体是6.4k。按说明书上的2：1比例混合的话，插入片段就得用350ng左右，但说明书上又建议最好不超过200ng,我用的是2：1的比例，10微升的体系，37度15分钟再50度15分钟，接下来都是按说明书上的做的，positive control长出菌落了，就我那个长不出来，不知道什么原因，我是不是应该把比例调到3：1,那样的话insert就得用500ng左右了，会不会太多，另外，我是不是应该延长一下37度和50度孵育的时间，以及做完转化后是不是得先用无抗的LB或SOC培养基复苏一下再涂板？
我的邮箱是jlulin@yeah.net，希望哪位高手能指点一下！！！

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1楼 2010-12-07 14:11:11

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shizishanshang

至尊木虫 (职业作家)

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引用回帖:

Originally posted by jlulin at 2010-12-07 14:11:11:
大家好，我现在做用In-Fusion® Advantage PCR Cloning Kit克隆，很头疼，怎么都长不出来啊，纠结啊，大侠们帮帮忙啊！！！我的insert和vector由于在需要的地方都没有酶切位点，所以用是用pcr方法扩增出来 ...

你好，现在做的怎么样了？
我也想开始做，不知道怎么做

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