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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教个关于inverse PCR的问题
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】请教个关于inverse PCR的问题已有6人参与

用cDNA环化的方法做IPCR ，使用RNA Lagise 加25%PEG18h环化，环化后立即PCR总是可以出带，但是-20过夜再进行PCR的时候就一直得不到任何条带，不知道怎么回事，哪位可以给分析一下，谢谢！！
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1楼2010-11-19 19:35:21
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by adslye at 2010-11-21 09:38:28:


我之前也是做过一次，我是想拿启动子。也没条带。感觉最大问题就是自连是否成功，另外就是PCR对浓度很低的环状DNA的敏感性了。这方面真的不是很有经验。等高手~
我另外也在用试剂盒，不过居然扩出了两边相同 ...

我也经常扩出两边相同引物的条带，而且都和目的条带差不多，很悲剧，现在我都加上左右单引物对照，费点事，放点心
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10楼2010-11-21 09:44:45
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hwamg

银虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-21 10:09:03
lz 你想想反向PCR的原理吧。环话的DNA你放-20℃，有可能内部局部配对，形成自身的二级机构。接着做PCR的过程中即使变性（denaturing）不一定能解开这个复杂的二级结构

解决这个问题，你可以试着适当延长变性时间

[ Last edited by hwamg on 2010-11-20 at 16:15 ]
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3楼2010-11-20 16:13:02
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adslye

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by lhwei1987 at 2010-11-19 19:35:21:
用cDNA环化的方法做IPCR ，使用RNA Lagise 加25%PEG18h环化，环化后立即PCR总是可以出带，但是-20过夜再进行PCR的时候就一直得不到任何条带，不知道怎么回事，哪位可以给分析一下，谢谢！！

楼主，你好。
虽然我帮不上你，但是我想请求你帮助。
我做的是双链DNA i-PCR,但是我没有自身环化的资料。分子克隆也只是写了尽量低的浓度。
可否把你自环化的详细步骤和体系公布下。谢谢！！！

另外，个人认为你-20过夜后，DNA抱团了，40°水浴1小时，让它们温和的舒张开，也许好点。另外，环状DNA做模板PCR本来就困难，多重复也许能行。
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4楼2010-11-20 23:50:30
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wangy0908

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
顶一下。收获了。我也是在做的inverse pcr。但是怎么也扩不出来。正在郁闷中
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5楼2010-11-21 03:51:56
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