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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PEGFP-N1与目的条带连不上
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wjger

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】PEGFP-N1与目的条带连不上 已有5人参与

载体：PEGFP-N1

目的基因大小：1500bp左右

酶切位点：Hind3、BamH1

连接酶：TAKARA T4连接酶

实验过程：PCR产物与19T-simple载体连接，双酶切后，载体带与目的带很好，回收目的带与PEGFP双酶切回收结果连接，一直连不上。
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1楼 2010-08-25 11:57:52
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snowice

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2):鼓励！ 2010-08-25 20:44:59
首先，大片断不太好连
再者，你是怎么判断是连接出了问题，感受态好不好用，做个载体自连实验吧，确定载体是切开的；注意一下连接体系载体和片段的比例，1:3~1:10吧，片段最好多点；16度连接过夜试试
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爱吃爱睡懒得要死的猪头
2楼2010-08-25 16:57:43
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wjger

新虫 (初入文坛)
感受态是买的，别人也在用，T载体能切下来，但连不上目的载体，所以判断连接出的问题。比例1:3~1:7，4度过夜。
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3楼2010-08-27 11:00:46
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wjger

新虫 (初入文坛)
连接酶借过别人正在用的试过，我们新买的也用过。
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4楼2010-08-27 11:02:56
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feiye2214

木虫 (正式写手)

我和你做的非常接近

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(金币+2):谢谢交流 2010-08-27 14:50:12
我做的是pEGFP-1连接一个1.6kb的片段，双酶切EcoR I/BamH I，1.6kb的片段是PCR出来的，两端已经将酶切位点设计进引物序列了，我酶切后也跑过电泳再回收胶中DNA（具备粘性末端）的，但是效果也不好
后来，直接不跑胶回收了，用清洁试剂盒来清洁PCR产物的酶切溶液和质粒的酶切溶液后，然后直接连接，转化，一次成功
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5楼2010-08-27 13:09:59
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sifantong

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
弱弱的问一句 什么是清洁试剂盒啊？
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6楼2010-08-28 16:58:54
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星之所在1991

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
如果在与pEGFP-N1的质粒载体中加入了终止子，就是基因在GFP之前但有终止子，常理来说应该不会表达GFP，可是问我的还是会表达，是终止子没有起作用吗？如果没有作用，那我这个质粒是不是可以用呢？
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7楼2015-03-23 21:51:42
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