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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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wjger

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】PEGFP-N1与目的条带连不上 已有5人参与

载体:PEGFP-N1

目的基因大小:1500bp左右

酶切位点:Hind3、BamH1

连接酶:TAKARA T4连接酶

实验过程:PCR产物与19T-simple载体连接,双酶切后,载体带与目的带很好,回收目的带与PEGFP双酶切回收结果连接,一直连不上。
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wjger

新虫 (初入文坛)

连接酶借过别人正在用的试过,我们新买的也用过。
4楼2010-08-27 11:02:56
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snowice

银虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2):鼓励! 2010-08-25 20:44:59
首先,大片断不太好连
再者,你是怎么判断是连接出了问题,感受态好不好用,做个载体自连实验吧,确定载体是切开的;注意一下连接体系载体和片段的比例,1:3~1:10吧,片段最好多点;16度连接过夜试试
爱吃爱睡懒得要死的猪头
2楼2010-08-25 16:57:43
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wjger

新虫 (初入文坛)

感受态是买的,别人也在用,T载体能切下来,但连不上目的载体,所以判断连接出的问题。比例1:3~1:7,4度过夜。
3楼2010-08-27 11:00:46
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feiye2214

木虫 (正式写手)

我和你做的非常接近

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
看天(金币+2):谢谢交流 2010-08-27 14:50:12
我做的是pEGFP-1连接一个1.6kb的片段,双酶切EcoR I/BamH I,1.6kb的片段是PCR出来的,两端已经将酶切位点设计进引物序列了,我酶切后也跑过电泳再回收胶中DNA(具备粘性末端)的,但是效果也不好
后来,直接不跑胶回收了,用清洁试剂盒来清洁PCR产物的酶切溶液和质粒的酶切溶液后,然后直接连接,转化,一次成功
5楼2010-08-27 13:09:59
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