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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】测序出现重叠峰是怎么回事？
汕头大学海洋科学接受调剂
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ztjren

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】测序出现重叠峰是怎么回事？ 已有8人参与

我是用PCR产物直接测序的，电泳图上条带很清楚也没有拖尾巴，会出现杂带吗？还有我的产物里是含染料的会有影响吗？
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1楼 2010-08-25 09:30:11
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bunny0512

银虫 (小有名气)
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1949stone(金币+1):华大还算还可 2010-08-25 12:08:12
我在北京。。用华大基因
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在哪里~在哪里见过你~
5楼2010-08-25 10:05:27
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普通回帖

周_yan

木虫 (小有名气)
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-08-25 12:07:36
我认为应该不是你说的这方面原因，而是测序时的问题，测序一个反应只能准确测700bp左右，超过这些就会测不准，出现重叠峰。当然也有可能是你pcr产物的问题。
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2楼2010-08-25 09:47:14
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ztjren

新虫 (初入文坛)
我的产物是1.9K，送去上海生工测的，好像网上对生工测序反应不太好，请教各位可有什么好的推荐，TAKARA测序如何？
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3楼2010-08-25 09:58:48
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周_yan

木虫 (小有名气)
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1949stone(金币+1):多少钱？ 2010-08-25 12:07:54
上海博尚测序不错。
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4楼2010-08-25 10:01:01
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wangxueqin

金虫 (小有名气)
★
1949stone(金币+1):是的 2010-08-25 12:08:22
PCR产物的问题，可能目的片段不纯，有杂事，或者是目的片段里面有AAAAAAAAAAAAAAAAAA之类的，也会造成出现杂峰
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6楼2010-08-25 10:12:50
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won7

金虫 (小有名气)
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1949stone(金币+1):有可能 2010-08-25 12:08:31
如果在600bp以内，峰比较尖但出现重叠峰，基本可以肯定是产物杂合，如二倍体或多倍体的核目的基因是杂合的。
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7楼2010-08-25 10:47:49
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ztjren

新虫 (初入文坛)
我送样的时候注明了是未纯化的PCR产物，难道生工直接拿来测序了么？
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8楼2010-08-25 11:56:34
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怎么都行

银虫 (小有名气)
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lstt09nk(金币+3):很好，很详细~~ 2010-08-25 12:30:54
引用回帖:
Originally posted by ztjren at 2010-08-25 11:56:34:
我送样的时候注明了是未纯化的PCR产物，难道生工直接拿来测序了么？

对你这个问题而言产物杂合跟纯不纯化没关系。如上楼所说，你如果是扩增多倍体的某段基因序列，在某个碱基座位上本来就存在等位基因的差异或SNP，那你扩增得到的PCR产物虽然长度相同，但其实是杂和产物，产物分子的碱基序列不是统一的，你用PCR产物直接测序，在等位基因有差异或SNP位点上必然是套峰。这种情况你该克隆挑单菌落测序了。
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9楼2010-08-25 12:12:24
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ztjren

新虫 (初入文坛)
原来是这个意思，学习了，请教若真是多倍体的话等位基因上的差异怎么通过克隆来区分开来呢，还有即便测出序列了又如何能代表该多倍体的基因，不会用多条序列来表示吧？我不太懂可能问的比较幼稚，请大家赐教。
我扩增的是肝吸虫的18S
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10楼2010-08-25 12:42:00
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