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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蓝白斑筛选
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sdluqun

铁杆木虫 (著名写手)

板砖队长

[交流] 【求助/交流】蓝白斑筛选 已有5人参与

做TA克隆，Amp/IPTG/X-gal的LB板子上没有长蓝斑，长了10个左右白斑，挑了一下，摇瓶过夜（加入氨苄），次日有6瓶长菌了，提质粒，琼脂糖电泳检测，却没有条带，这是为什么呢？请大家给点意见，谢谢
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尔非我焉知我悲喜
1楼 2010-06-04 15:10:51
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ben1147

木虫 (正式写手)
sdluqun(金币+1):质粒提取还是用之前的试剂盒，抗生素用于筛选的时候还可行...谢谢您的意见 2010-06-04 15:16:15
sdluqun(金币+1): 2010-06-04 15:26:09
抗生素失效
或者
质粒提取过程有问题
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2楼2010-06-04 15:13:43
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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sdluqun(金币+1):我这次全部涂了，请问你一般自己做感受态还是买的商业化的？我用的是自己做的 2010-06-04 15:30:40
蓝白斑筛选，长的够少的，你是涂了多少还是全涂了。奇怪你怎么才长10个呢
我一般要是涂100ul的话就能长的满板子，一般都会有几个篮板。如果提不出质粒来，很可能长的是杂菌。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
3楼2010-06-04 15:26:49
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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sdluqun(金币+1):恩 我也是按这个自己做的 转的一个环形质粒 长得很满 所以觉得也不是感受态的问题 这个实验都把我困了一个多月了 郁闷啊 2010-06-04 18:12:04
就是用改良氯化钙法自己做的。。效率可以。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-06-04 15:33:27
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ben1147

木虫 (正式写手)
sdluqun(金币+1):好的 谢谢交流 2010-06-04 18:12:37
感受态是做好之后第一次用么？

感受态不转东西直接涂个氨苄板，看看是不是污染了
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5楼2010-06-04 15:52:43
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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★ ★ ★
lstt09nk(金币+3):感谢分享经验~~ 2010-06-04 18:48:22
sdluqun(金币+5):之前用Takara的做了好几次，什么也没找，我就买了promega的，体系用的就是您说的这个，也是4度冰箱过夜，这次出现了这种情况，哎，我都郁闷的不行了 2010-06-04 22:28:52
引用回帖:
Originally posted by sdluqun at 2010-06-04 15:10:51:
做TA克隆，Amp/IPTG/X-gal的LB板子上没有长蓝斑，长了10个左右白斑，挑了一下，摇瓶过夜（加入氨苄），次日有6瓶长菌了，提质粒，琼脂糖电泳检测，却没有条带，这是为什么呢？请大家给点意见，谢谢

你用的Taq酶应该能在末尾加A吧，不知道你是用的什么T载体，我们用的是promego的pGEM-T easy ，链接体系一般：
pGEM-T easy  1 ul
连接酶           1ul
2*buffer        5ul
连接片段        3ul

4℃连接过夜，效率挺高的啊。

[ Last edited by fungixx on 2010-6-4 at 18:22 ]
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
6楼2010-06-04 18:19:26
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85715623

木虫 (正式写手)
sdluqun(金币+1): 2010-06-04 22:30:05
估计是感受态细胞出了问题。
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7楼2010-06-04 18:22:16
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王碧寒

金虫 (小有名气)
sdluqun(金币+1):谢谢您的意见，插入片段不对是什么意思呢？ 2010-06-05 22:53:01
我遇到过这种情况，有可能插入的片段不对，amp板容易长杂菌
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8楼2010-06-05 11:32:45
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奋斗的猪猪

银虫 (初入文坛)
sdluqun(金币+2):谢谢 这个还真没系统做过 我再试试 2010-06-05 22:53:36
现在看来药品都没有问题，是不是考虑一下的你的连接体系呢，DNA的量可以调整一下试试吧。而且，蓝白斑筛选的假阳性也是有的。多试几次就好了，有些东西不是我们想像的那么好用。不然好多研究早就做出来了。
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9楼2010-06-05 15:35:19
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