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牵着猎人的狼

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】pcr问题求助 已有8人参与

请问谁p过真菌的ITS?
小半年了,一直p都没p出来,ITS应该是很保守的序列,我p的是尖孢镰刀菌的。
我用的引物是:
ITS4:TCC TCC gCT TAT TgA TAT gC       Tm:55.75
ITS5:ggA Agg TAA AAg TCA Agg             Tm:52.74
我的体系是:20
双蒸水:12
10*buffer:2
镁离子:1.5
dNTP:1
P1:1
P2:1
模版:1
Taq酶:0.5
程序:94度5min,94度30s,44度45s,72度1min(30 cycle) 72度10min 4度保存。
请指教,不胜感激
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xuezhen

银虫 (小有名气)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
这么低的退火温度还P不出来,会不会是模板的原因?引物酶问题吧?
2楼2010-05-26 20:14:54
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牵着猎人的狼

银虫 (小有名气)

实验室师兄用相同的体系,药品,引物,程序p出来过,模版DNA条带很亮。
3楼2010-05-26 20:31:38
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

★ ★
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scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-05-27 00:04:47
20ul 体系一般模板 酶 引物都加0.4微升啊~我是这样的体系!退火温度低,一般都在50以上!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2010-05-26 20:32:37
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gastrodia

金虫 (正式写手)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
72度延伸1min是不是有点短啊
5楼2010-05-26 21:01:21
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langgenet

木虫 (正式写手)

狼哥

不懂,顶下~~~
细节决定成败
6楼2010-05-26 21:10:32
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shangshang

木虫 (正式写手)

pcr

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你dNTP浓度是多大的?如果是10mM的,你就加的有点多了。
学无止境
7楼2010-05-27 08:38:09
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weekend883

金虫 (小有名气)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
退火温度太低了,我做的时候用的50度,楼主各成分的添加量都有点大,模板的浓度很重要,如果模板浓度大的话,那你添加这些就太多了
8楼2010-05-27 09:11:01
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darwinxie

铁杆木虫 (职业作家)

自强瓜族族长-----呆瓜大叔

好p才是啊
一切都会好的,雨后的天空更加明朗!人生苦短,快乐至上,加油!
9楼2010-05-27 09:28:24
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