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牵着猎人的狼

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】pcr问题求助 已有8人参与

请问谁p过真菌的ITS?
小半年了，一直p都没p出来，ITS应该是很保守的序列，我p的是尖孢镰刀菌的。
我用的引物是：
ITS4：TCC TCC gCT TAT TgA TAT gC       Tm：55.75
ITS5：ggA Agg TAA AAg TCA Agg             Tm：52.74
我的体系是：20
双蒸水：12
10*buffer：2
镁离子：1.5
dNTP：1
P1：1
P2：1
模版：1
Taq酶：0.5
程序：94度5min，94度30s，44度45s，72度1min(30 cycle) 72度10min 4度保存。
请指教，不胜感激
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1楼 2010-05-26 20:11:22
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xuezhen

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这么低的退火温度还P不出来，会不会是模板的原因？引物酶问题吧？
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2楼2010-05-26 20:14:54
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牵着猎人的狼

银虫 (小有名气)
实验室师兄用相同的体系，药品，引物，程序p出来过，模版DNA条带很亮。
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3楼2010-05-26 20:31:38
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★
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scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-27 00:04:47
20ul 体系一般模板 酶 引物都加0.4微升啊~我是这样的体系!退火温度低，一般都在50以上！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2010-05-26 20:32:37
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
72度延伸1min是不是有点短啊
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5楼2010-05-26 21:01:21
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langgenet

木虫 (正式写手)

狼哥
不懂，顶下～～～
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细节决定成败
6楼2010-05-26 21:10:32
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shangshang

木虫 (正式写手)

pcr

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你dNTP浓度是多大的？如果是10mM的，你就加的有点多了。
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学无止境
7楼2010-05-27 08:38:09
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weekend883

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
退火温度太低了，我做的时候用的50度，楼主各成分的添加量都有点大，模板的浓度很重要，如果模板浓度大的话，那你添加这些就太多了
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8楼2010-05-27 09:11:01
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darwinxie

铁杆木虫 (职业作家)

自强瓜族族长-----呆瓜大叔
好p才是啊
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一切都会好的，雨后的天空更加明朗！人生苦短，快乐至上，加油！
9楼2010-05-27 09:28:24
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