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夏尔list

金虫 (著名写手)


[交流] 【求助/交流】PCR的问题

扩一个基因,1314bp,GC含量约有63%。
25微升体系如下:引物 0.5/0.5
                       10乘buffer 2.5
                            dNTP         0.5
                            Taq酶        0.5
                        cDNA(模板)1
                           DMSO          1
                           ddH2O       18.5

扩增设计:95℃         5min
                 95℃          45s
                 58、63℃   45s
                 72℃          1min30s
                 72℃           10min
                  4℃            hold
28个循环
扩了三次没有扩出来
GC含量高,一会准备换个GC buffer,但是师姐说那个没有什么用处。
请教各位大侠~~~
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xingxing342

银虫 (小有名气)



夏尔list(金币+1): 谢谢 2011-03-01 19:03:32
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-01 19:49:04
1.退火温度,引物量,酶量等做几个梯度,优化一下。
2.模板在提纯一些
3.换换PCR仪
还不出的话,可能是引物设计的不好吧。你加DMSO就是说你的东西不好P,在好好弄弄引物吧。
2楼2011-03-01 15:51:03
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夏尔list(金币+2): 谢谢 2011-03-01 19:04:54
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-01 19:49:11
63%的GC还不算太高
撤掉DMSO看看,DMSO不一定都是增强剂,有可能抑制PCR反应
另外,换个活力好的酶吧
3楼2011-03-01 18:50:09
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夏尔list

金虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-03-01 18:50:09:
63%的GC还不算太高
撤掉DMSO看看,DMSO不一定都是增强剂,有可能抑制PCR反应
另外,换个活力好的酶吧

我查了文献说DMSO在6%——13%时效果最好,低于4%或者高于20%就不行了,25微升体系1微升的DMSO,差不多是4%,那么应该再增加DMSO呀。。。
嗯,我再用高保真酶扩一下,谢谢
4楼2011-03-01 19:11:15
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夏尔list(金币+1): 谢谢~ 2011-03-01 19:39:57
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-01 19:49:25
GC buffer还是有用的
我P过GC 72%的,只有加了GC buffer才行
5楼2011-03-01 19:30:33
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翱宇

禁虫 (正式写手)



lstt09nk(金币+1): 鼓励新斑斑~ 2011-03-01 20:03:54
夏尔list(金币+1): 谢谢 2011-03-01 20:06:29
退火温度太高了,假如做的是温度梯度,试试50-60度吧,DMSO在5%就可以,为何那么多呢!这玩意多了也不好的。
6楼2011-03-01 20:00:15
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夏尔list

金虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by 翱宇 at 2011-03-01 20:00:15:
退火温度太高了,假如做的是温度梯度,试试50-60度吧,DMSO在5%就可以,为何那么多呢!这玩意多了也不好的。

Primer5设计的引物温度是65摄氏度,已经降了很多了。。。片段起始区GC含量就很高,没办法额
7楼2011-03-01 20:06:19
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wlsky24

新虫 (正式写手)


夏尔list(金币+2): 嗯,谢谢~~ 2011-03-01 21:30:40
换个高保真酶试试。
8楼2011-03-01 21:28:09
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