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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR的问题
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夏尔list

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】PCR的问题

扩一个基因，1314bp，GC含量约有63%。
25微升体系如下：引物 0.5/0.5
                       10乘buffer 2.5
                            dNTP         0.5
                            Taq酶        0.5
                        cDNA（模板）1
                           DMSO          1
                           ddH2O       18.5

扩增设计：95℃         5min
                 95℃          45s
                 58、63℃   45s
                 72℃          1min30s
                 72℃           10min
                  4℃            hold
28个循环
扩了三次没有扩出来
GC含量高，一会准备换个GC buffer，但是师姐说那个没有什么用处。
请教各位大侠~~~
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1楼2011-03-01 15:35:01
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xingxing342

银虫 (小有名气)
★
夏尔list(金币+1): 谢谢 2011-03-01 19:03:32
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-01 19:49:04
1.退火温度，引物量，酶量等做几个梯度，优化一下。
2.模板在提纯一些
3.换换PCR仪
还不出的话，可能是引物设计的不好吧。你加DMSO就是说你的东西不好P，在好好弄弄引物吧。
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2楼2011-03-01 15:51:03
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
夏尔list(金币+2): 谢谢 2011-03-01 19:04:54
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-01 19:49:11
63%的GC还不算太高
撤掉DMSO看看，DMSO不一定都是增强剂，有可能抑制PCR反应
另外，换个活力好的酶吧
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3楼2011-03-01 18:50:09
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夏尔list

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-03-01 18:50:09:
63%的GC还不算太高
撤掉DMSO看看，DMSO不一定都是增强剂，有可能抑制PCR反应
另外，换个活力好的酶吧

我查了文献说ＤＭＳＯ在６％——１３％时效果最好，低于４％或者高于２０％就不行了，２５微升体系１微升的ＤＭＳＯ，差不多是４％，那么应该再增加ＤＭＳＯ呀。。。
嗯，我再用高保真酶扩一下，谢谢
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4楼2011-03-01 19:11:15
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★
夏尔list(金币+1): 谢谢~ 2011-03-01 19:39:57
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-01 19:49:25
GC buffer还是有用的
我P过GC 72%的，只有加了GC buffer才行
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5楼2011-03-01 19:30:33
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翱宇

禁虫 (正式写手)
★
lstt09nk(金币+1): 鼓励新斑斑~ 2011-03-01 20:03:54
夏尔list(金币+1): 谢谢 2011-03-01 20:06:29
退火温度太高了，假如做的是温度梯度，试试50-60度吧，DMSO在5%就可以，为何那么多呢！这玩意多了也不好的。
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6楼2011-03-01 20:00:15
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夏尔list

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 翱宇 at 2011-03-01 20:00:15:
退火温度太高了，假如做的是温度梯度，试试50-60度吧，DMSO在5%就可以，为何那么多呢！这玩意多了也不好的。

Primer5设计的引物温度是65摄氏度，已经降了很多了。。。片段起始区GC含量就很高，没办法额
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7楼2011-03-01 20:06:19
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wlsky24

新虫 (正式写手)
夏尔list(金币+2): 嗯，谢谢~~ 2011-03-01 21:30:40
换个高保真酶试试。
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8楼2011-03-01 21:28:09
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