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夏尔list

金虫 (著名写手)

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虫号: 1174302

[交流] 【求助/交流】PCR的问题

扩一个基因，1314bp，GC含量约有63%。
25微升体系如下：引物 0.5/0.5
                     10乘buffer 2.5
                        dNTP       0.5
                        Taq酶       0.5
                     cDNA（模板）1
                        DMSO       1
                        ddH2O    18.5

扩增设计：95℃       5min
               95℃       45s
               58、63℃ 45s
               72℃       1min30s
               72℃          10min
               4℃          hold
28个循环
扩了三次没有扩出来
GC含量高，一会准备换个GC buffer，但是师姐说那个没有什么用处。
请教各位大侠~~~

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1楼 2011-03-01 15:35:01

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夏尔list

金虫 (著名写手)

应助: 121 (高中生)
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虫号: 1174302

引用回帖:

Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-03-01 18:50:09:
63%的GC还不算太高
撤掉DMSO看看，DMSO不一定都是增强剂，有可能抑制PCR反应
另外，换个活力好的酶吧

我查了文献说ＤＭＳＯ在６％——１３％时效果最好，低于４％或者高于２０％就不行了，２５微升体系１微升的ＤＭＳＯ，差不多是４％，那么应该再增加ＤＭＳＯ呀。。。
嗯，我再用高保真酶扩一下，谢谢

4楼2011-03-01 19:11:15

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xingxing342

银虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
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虫号: 538234

★
夏尔list(金币+1): 谢谢 2011-03-01 19:03:32
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-01 19:49:04

1.退火温度，引物量，酶量等做几个梯度，优化一下。
2.模板在提纯一些
3.换换PCR仪
还不出的话，可能是引物设计的不好吧。你加DMSO就是说你的东西不好P，在好好弄弄引物吧。

赞一下(1人)

2楼2011-03-01 15:51:03

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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★
夏尔list(金币+2): 谢谢 2011-03-01 19:04:54
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-01 19:49:11

63%的GC还不算太高
撤掉DMSO看看，DMSO不一定都是增强剂，有可能抑制PCR反应
另外，换个活力好的酶吧

赞一下(1人)

3楼2011-03-01 18:50:09

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roomofxw

木虫 (正式写手)

★
夏尔list(金币+1): 谢谢~ 2011-03-01 19:39:57
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-01 19:49:25

GC buffer还是有用的
我P过GC 72%的，只有加了GC buffer才行

赞一下(1人)

5楼2011-03-01 19:30:33

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