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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】大量金币感谢，基因克隆表达。
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zhmy26

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】大量金币感谢，基因克隆表达。 已有12人参与

我想在E.coli中表达一个外源基因，并且要这个基因表达出来具有酶活性，能够转化底物，合成新的产物。但是有一点不明白的就是：在克隆外源基因的时候，从ATG开始，到TAA结束？还是从更上游的位置开始到更下游的位置结束？这两者之间有什么区别呢？
第二个问题：如果在同一载体上克隆表达两个基因，这两个基因如何连接呢？是第一个基因的TAA直接续接第二个基因的ATG？还是中间需要添加一些片段？
各位大侠啊：我是在读的硕士研究生，要开展分子生物学的课题。由于导师在这方面不太精通，因此求助一个问题。

[ Last edited by zhmy26 on 2010-5-12 at 08:28 ]
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1楼 2010-05-05 08:36:40
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追逐梦想

银虫 (小有名气)
★ ★
zhmy26(金币+1): 2010-05-05 13:54:31
scelab(金币+2):鼓励新虫！欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-05 15:33:23
第一个问题 是 你的质粒上没有启动子的话 要扩ATG前的一段序列，这是启动子序列！
第二是 可以用SOE的方法 吧两个基因连接起来！具体步骤你可以网上搜一下！
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追逐梦想！
2楼2010-05-05 08:44:45
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
zhmy26(金币+2): 2010-05-05 13:54:51
scelab(金币+4):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-05 15:33:31
有很多载体可以选择，比如pet系列的。看你的要求，你可以使用非融合表达，即表达时不带标签，可以表达出天然的目的蛋白。一般表达载体都是载体具有启动子的，不需要自行添加，你只需将目的基因插入相应的酶切位点就可以了，至于终止，你可以使用载体上的终止子，你也可以在设计引物时自己加上双终止子TGATAA，我们一般都是自己加双终止子。表达的时候，载体是从启动子之后的第一个ATG开始表达，直到终止密码子。
第二个问题，现在有很多双表达系统可以选择，这种系统具有多个启动子，可以插入多个目的基因，这种系统表达出来的每个蛋白是独立分开的。而楼上介绍的SOE拼接表达出来的两个蛋白一般是连在一起的。
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生物资源交流QQ群：1044518333
3楼2010-05-05 09:34:30
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★ ★
zhmy26(金币+1): 2010-05-05 13:56:02
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-05 15:33:38
1，如果是在大肠中表达只需要ORF就可以了，一般商业化的表达载体都含有启动子和终止子，你只需要把你的orf插入到启动子与终止子中间的多克隆位点
2.在同一载体上表达两个基因，一般需要两个转录单元，每个基因在各自的启动子控制之下
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-05-05 09:40:27
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liyong1981

金虫 (正式写手)
zhmy26(金币+1): 2010-05-05 13:56:19
zhmy26(金币+1): 2010-05-11 08:23:07
同意楼上两位～基本上，你多看看书吧，或者相关文献～
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5楼2010-05-05 13:43:59
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stliimoon

金虫 (小有名气)
★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-05 15:33:55
如果你是在NCBI上找到的基因，先在这个基因找ORF，一般它给的基因都是有ORF的，你可以用DNAMAN或其他的软件翻译下看看，找到之后，确定表达载体后，在设计引物，加酶切位点，保护碱基，然后调取基因，酶切连接，转化，筛选。
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6楼2010-05-05 14:14:30
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匿名

用户注销 (正式写手)
zhmy26(金币+1): 2010-05-05 21:14:12
zhmy26(金币+1): 2010-07-09 15:57:42
本帖仅楼主可见
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7楼2010-05-05 16:11:46
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zhmy26

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by snoopyzxx at 2010-05-05 09:34:30:
有很多载体可以选择，比如pet系列的。看你的要求，你可以使用非融合表达，即表达时不带标签，可以表达出天然的目的蛋白。一般表达载体都是载体具有启动子的，不需要自行添加，你只需将目的基因插入相应的酶切位点 ...

您所说的双终止子如何设计？是直接在ATG.......TAA中，把TAA换成双终止子，还是在TAA后面添加双终止子呢？
您外您所述的双表达系统可否给出几个名称？非常感谢。
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8楼2010-05-11 08:26:36
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zhjp326

铁杆木虫 (正式写手)
zhmy26(金币+1): 2010-05-11 15:18:52
这个和你的片段及载体有关。两个基因可以连在一起表达，当然不在一起也是可以的，我个人觉的不在一起会简单些。这方面一句话也说不清楚，建议好好把这方面的书好好看看，尤其分子生物学和基因八
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9楼2010-05-11 08:41:33
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最爱花诗雨

金虫 (正式写手)

穷鬼
zhmy26(金币+1): 2010-05-11 15:19:09
感觉楼上几位说的已经很好了，自己也罗嗦几句，我也刚开始基因的学习，第一个问题可以按照1楼的做法，不过似乎你是想一次性连接2个基因到一个载体上，我们实验室的一个师兄做的也是多基因连接，好像是直接连到一起的，至于双表达系统，可以学习一下，我感觉楼主现在似乎还不是很清楚自己的蛋白是连载一起的还是独立的，要是这样的话，可以用两个方法都试试，也可以自己再去查文献证实后再决定，反正就是一个从理论入手一个从实践做起，都可以解决。祝楼主好运~~
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严于律己，宽以待人
10楼2010-05-11 09:21:02
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