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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】大量金币感谢，基因克隆表达。
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zhmy26

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】大量金币感谢，基因克隆表达。 已有12人参与

我想在E.coli中表达一个外源基因，并且要这个基因表达出来具有酶活性，能够转化底物，合成新的产物。但是有一点不明白的就是：在克隆外源基因的时候，从ATG开始，到TAA结束？还是从更上游的位置开始到更下游的位置结束？这两者之间有什么区别呢？
第二个问题：如果在同一载体上克隆表达两个基因，这两个基因如何连接呢？是第一个基因的TAA直接续接第二个基因的ATG？还是中间需要添加一些片段？
各位大侠啊：我是在读的硕士研究生，要开展分子生物学的课题。由于导师在这方面不太精通，因此求助一个问题。

[ Last edited by zhmy26 on 2010-5-12 at 08:28 ]
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1楼 2010-05-05 08:36:40
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stliimoon

金虫 (小有名气)
★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-05 15:33:55
如果你是在NCBI上找到的基因，先在这个基因找ORF，一般它给的基因都是有ORF的，你可以用DNAMAN或其他的软件翻译下看看，找到之后，确定表达载体后，在设计引物，加酶切位点，保护碱基，然后调取基因，酶切连接，转化，筛选。
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6楼2010-05-05 14:14:30
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追逐梦想

银虫 (小有名气)
★ ★
zhmy26(金币+1): 2010-05-05 13:54:31
scelab(金币+2):鼓励新虫！欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-05 15:33:23
第一个问题 是 你的质粒上没有启动子的话 要扩ATG前的一段序列，这是启动子序列！
第二是 可以用SOE的方法 吧两个基因连接起来！具体步骤你可以网上搜一下！
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追逐梦想！
2楼2010-05-05 08:44:45
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
zhmy26(金币+2): 2010-05-05 13:54:51
scelab(金币+4):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-05 15:33:31
有很多载体可以选择，比如pet系列的。看你的要求，你可以使用非融合表达，即表达时不带标签，可以表达出天然的目的蛋白。一般表达载体都是载体具有启动子的，不需要自行添加，你只需将目的基因插入相应的酶切位点就可以了，至于终止，你可以使用载体上的终止子，你也可以在设计引物时自己加上双终止子TGATAA，我们一般都是自己加双终止子。表达的时候，载体是从启动子之后的第一个ATG开始表达，直到终止密码子。
第二个问题，现在有很多双表达系统可以选择，这种系统具有多个启动子，可以插入多个目的基因，这种系统表达出来的每个蛋白是独立分开的。而楼上介绍的SOE拼接表达出来的两个蛋白一般是连在一起的。
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生物资源交流QQ群：1044518333
3楼2010-05-05 09:34:30
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★ ★
zhmy26(金币+1): 2010-05-05 13:56:02
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-05 15:33:38
1，如果是在大肠中表达只需要ORF就可以了，一般商业化的表达载体都含有启动子和终止子，你只需要把你的orf插入到启动子与终止子中间的多克隆位点
2.在同一载体上表达两个基因，一般需要两个转录单元，每个基因在各自的启动子控制之下
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-05-05 09:40:27
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