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请，你微笑

新虫 (初入文坛)
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重叠延伸PCR求助
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我做重叠延伸PCR连接大片段的时候总是不出目的条带，并且会出一些固定的杂带，但都不是小片段的大小。期间调整过温度，模板浓度，引物浓度都没起作用，求各位大神帮忙！！！下图为PCR结果，上图的目的片段为2500，下图的目的条带为3092。

重叠延伸PCR求助


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1楼 2017-07-30 18:17:50
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请，你微笑

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 六维空想 at 2017-07-31 06:28:33
你是怎么做的  这么大的片段不算难吧

比如我有四个片段1，2，3，4。先用重叠延伸把1和2连起来（用1-2表示）；3和4连起来（用3-4表示）。然后再将1-2和3-4作为模板，先不加引物让它搭桥P 15个循环，再加引物P 30个循环，最后想得到一个1-2-3-4连接起来的片段，约3000bp

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8楼2017-07-31 14:41:35
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六维空想

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你是怎么做的  这么大的片段不算难吧

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7楼2017-07-31 06:28:33
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王查查23

禁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
9楼2017-07-31 19:04:13
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王查查23

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
10楼2017-07-31 19:04:57
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as1688816

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-08-01 07:45:46
引用回帖:
8楼: Originally posted by 请，你微笑 at 2017-07-31 14:41:35
比如我有四个片段1，2，3，4。先用重叠延伸把1和2连起来（用1-2表示）；3和4连起来（用3-4表示）。然后再将1-2和3-4作为模板，先不加引物让它搭桥P 15个循环，再加引物P 30个循环，最后想得到一个1-2-3-4连接起来的 ...

没必要单独搭桥，直接将前两种产物作为模板混合加正常两端引物扩就行了。

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11楼2017-07-31 23:39:57
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六维空想

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by 请，你微笑 at 2017-07-31 14:41:35
比如我有四个片段1，2，3，4。先用重叠延伸把1和2连起来（用1-2表示）；3和4连起来（用3-4表示）。然后再将1-2和3-4作为模板，先不加引物让它搭桥P 15个循环，再加引物P 30个循环，最后想得到一个1-2-3-4连接起来的 ...

第一次重叠的片段确定是对的么  第二次重叠两个片段加了多少？ 我之前做一轮不加引物10个循环  片段 大概1kb大小加100ng，二轮加引物  取一轮0.5或者1ul 作为模板  30循环   如果连不上  可以尝试把之前重叠的片段连接克隆载体测下序，再重新p下来重叠，

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12楼2017-08-01 10:40:16
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新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 六维空想 at 2017-08-01 10:40:16
第一次重叠的片段确定是对的么  第二次重叠两个片段加了多少？ 我之前做一轮不加引物10个循环  片段 大概1kb大小加100ng，二轮加引物  取一轮0.5或者1ul 作为模板  30循环   如果连不上  可以尝试把之前重叠的片段 ...

没有测过序，都是用肉眼来判断位置的，模板浓度是10 ng左右，按照酶的说明书加的。

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13楼2017-08-01 16:02:20
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请，你微笑

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by as1688816 at 2017-07-31 23:39:57
没必要单独搭桥，直接将前两种产物作为模板混合加正常两端引物扩就行了。
...

直接加引物也P过，还是不行

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14楼2017-08-01 16:03:09
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新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 王查查23 at 2017-07-31 19:04:57
请问，先不加搭桥引物是什么意思？没看懂
...

就是那两个片段之间有一部分是重叠的，先不加引物就是让这部分先连起来，然后再大量P

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15楼2017-08-01 16:05:01
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新虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by 王查查23 at 2017-07-31 19:04:13
买个无缝克隆的试剂盒，50°，15分钟就行了

无缝克隆试剂盒不是要片段少的话成功的概率才高吗？我现在有四个片段啊。 你有做过好几个片段的连接吗？

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16楼2017-08-01 16:07:14
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zou13142楼
2017-07-30 18:18   回复  
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pandongzi3楼
2017-07-30 18:18   回复  
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懒懒行空4楼
2017-07-30 18:18   回复  
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phdl5楼
2017-07-30 18:18   回复  
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184049049266楼
2017-07-30 18:18   回复  
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