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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重叠延伸PCR求助
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请，你微笑

新虫 (初入文坛)
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重叠延伸PCR求助
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我做重叠延伸PCR连接大片段的时候总是不出目的条带，并且会出一些固定的杂带，但都不是小片段的大小。期间调整过温度，模板浓度，引物浓度都没起作用，求各位大神帮忙！！！下图为PCR结果，上图的目的片段为2500，下图的目的条带为3092。

重叠延伸PCR求助


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1楼 2017-07-30 18:17:50
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请，你微笑

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 六维空想 at 2017-08-01 10:40:16
第一次重叠的片段确定是对的么  第二次重叠两个片段加了多少？ 我之前做一轮不加引物10个循环  片段 大概1kb大小加100ng，二轮加引物  取一轮0.5或者1ul 作为模板  30循环   如果连不上  可以尝试把之前重叠的片段 ...

没有测过序，都是用肉眼来判断位置的，模板浓度是10 ng左右，按照酶的说明书加的。

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13楼2017-08-01 16:02:20
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六维空想

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你是怎么做的  这么大的片段不算难吧

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7楼2017-07-31 06:28:33
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请，你微笑

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 六维空想 at 2017-07-31 06:28:33
你是怎么做的  这么大的片段不算难吧

比如我有四个片段1，2，3，4。先用重叠延伸把1和2连起来（用1-2表示）；3和4连起来（用3-4表示）。然后再将1-2和3-4作为模板，先不加引物让它搭桥P 15个循环，再加引物P 30个循环，最后想得到一个1-2-3-4连接起来的片段，约3000bp

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8楼2017-07-31 14:41:35
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王查查23

禁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
9楼2017-07-31 19:04:13
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phdl5楼
2017-07-30 18:18   回复  
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pandongzi3楼
2017-07-30 18:18   回复  
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懒懒行空4楼
2017-07-30 18:18   回复  
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zou13142楼
2017-07-30 18:18   回复  
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184049049266楼
2017-07-30 18:18   回复  
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