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曲酒封琴

木虫 (正式写手)

[求助] 求助重叠延伸PCR 已有1人参与

求助重叠延伸PCR的基本原理和方法
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1楼 2015-11-17 13:59:57
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Tintin77

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
曲酒封琴: 金币+200, ★★★★★最佳答案, 好有帮助啊，受益匪浅。。。。 2015-11-17 14:06:01
重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物.重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计.重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。
以下是重叠延伸PCR的原理及两基因的引物设计：
A基因：
上游（F1）与开放阅读框起始密码子附近的序列相对应，并在5 ’末端添加酶切位点和3个保护碱基；下游（R1）与A基因终止密码子附近的序列及B基因5’末端起始密码子附近的序列互补，并去除A基因的终止密码子TAA
B基因：
上游（F2）与A基因终止密码子附近的序列及B基因5 ’端起始密码子附近的序列相对应，同样去除A基因终止密码子TAA；下游（R2）与B基因的开放阅读框终止密码子序列互补，并在5’末端添加酶切位点和2个保护碱基。

先分别用F1、R1，F2、R2扩增出A和B基因，然后再用F1和R2将两基因连接起来，得到融合基因。
外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。而采用重叠引物PCR介导的定点突变实验是一种快速有效的在基因中特定位点引入特定突变的有效技术。该技术采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链, 从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。该技术主要包括以下几步：设计引物，PCR扩增基因两端，回收两端片段，两端片段退火延伸，扩增全长基因。
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2楼2015-11-17 14:05:03
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曲酒封琴

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Tintin77 at 2015-11-17 14:05:03
重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用P ...

。。。。。。
3楼2015-11-17 14:09:42
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九品品

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Tintin77 at 2015-11-17 14:05:03
重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用P ...

你说先扩增2个片段，再2端退火延伸，这会不用加引物吧
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4楼2016-10-22 11:21:09
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Tintin77

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 九品品 at 2016-10-22 11:21:09
你说先扩增2个片段，再2端退火延伸，这会不用加引物吧...

需要加两端的上下游引物，两个片段按比例添加1:1，其它pcr成分都需要添加，之后运行PCR，回收长片段

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5楼2016-10-28 22:55:54
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