应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 克隆连接18-T连接不上
51/1返回列表
查看: 916  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

wy604987664

新虫 (小有名气)

[求助] 克隆连接18-T连接不上 已有2人参与

克隆启动子1530bp，使用克隆引物pcr，然后纯化回收，跑胶没问题。连接PMD18-T，用天根DH5α感受太13小时左右挑单克隆，采用天根普通taq酶，引物用M13进行菌液pcr，没条带（延伸时间2min）。连接转化两次都没条带，是普通酶扩增不出1500的条带？还是什么原因？？

发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2017-07-17 21:28:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wy604987664

新虫 (小有名气)
pcr用的taq高保真酶末端有A，连接18-T用了1小时多

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
2楼2017-07-17 21:37:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

豆豆君123

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
3楼2017-07-17 22:37:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-07-17 23:22:19
1、你可以用蓝白斑筛选克隆，另外你用的PCR酶是不是高保真酶，如果是肯定连不上，因为高保真酶扩增出来的片段是平段的，而T载体要求PCR片段末段带A。

2、T载体是TA克隆载体的简称，就是利用载体的T末端和PCR产物的A末段连接而将目的基因克隆到载体中的方法。
赞一下(1人) 回复此楼
及时行乐，人生不留遗憾！
4楼2017-07-17 23:05:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先你要确定到底连接上没有，可以取1微升连接产物，作为模板，用M13通用引物扩增。如果扩增出目的条带，说明就连上了，可能是转化的问题。如果没有，那可能就是连接的原因，可以试一下提高产物浓度，延伸连接时间。 另外pMD18-T是支持蓝白斑筛选的，你可以通过这个筛选白斑。如果都是蓝斑，那就别浪费时间挑斑了。
祝好
赞一下(2人) 回复此楼
对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
5楼2017-07-18 00:34:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wy604987664 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭