| 查看: 2217 | 回复: 1 | ||
[求助]
基因克隆PCR检测不出阳性克隆
|
|
请高手帮忙解决一下。目前正在进行载体的构建，将载体骨架进行酶切，切胶回收背景。同时克隆出目的片段，连接pGEM-T载体，转化大肠杆菌，PCR检测阳性克隆，如图1，经测序证明结果正确，选择阳性克隆进行酶切，切胶回收目的片段。背景与目的片段连接过夜，转化大肠杆菌，挑单克隆检测，此时PCR检测无法检测出阳性克隆，提取质粒后酶切检测，均为阳性，如图2，选择阳性克隆1转化农杆菌，挑取单克隆检测，此时PCR仍无法检测出阳性，但双酶切结果及单酶切比较验证均证实转化成功。利用与之前完全相同的体系对起始模板、大肠杆菌阳性克隆，以及转化的农杆菌进行PCR，体系仪器与之前完全相同，但是结果所有的PCR均无条带。酶是一个半月之前购买的，检测过没有问题，引物应该也没有问题，后来以为是dNTP的问题，试了实验室所有的dNTP，也可以扩增出来目的片段见图3，但利用相同的体系和程序又扩不出带了见图4，实在是想不出问题到底出在哪里了，急求各位帮忙啊，感激不尽。 PS：所构建的新载体与原始载体只有酶切位点之内有差异，引物经比对与所构建的载体匹配，理论上可以用PCR检测阳性克隆，但始终无法扩增出目的片段。  图4  图1  图2  图3 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有71人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 请问能不能仅克隆单一基因的一小片段
已经有4人回复
- pcr，RACE,低表达量基因的克隆
已经有8人回复
- pcr产物测序和克隆之后重组质粒测序结果一样吗？
已经有12人回复
- 克隆基因连接到载体上测序发现有一个点突变怎么办？
已经有16人回复
- 【求助/交流】急！克隆快做了一个月了，就是做不出来
已经有24人回复
- 【求助/交流】菌液PCR鉴定阳性克隆时，总出现非特异性条带
已经有8人回复
- 【求助/交流】菌液PCR鉴定阳性克隆时，总出现CK
已经有4人回复
- 【求助/交流】基因克隆时，酶切有结果，PCR却P不出来
已经有11人回复
- 【求助/交流】基因克隆前PCR产物都要纯化吗？
已经有15人回复
- 【求助/交流】从RNA到cDNA合成再到克隆PCR的实验技巧和操作细节问题若干，寻求解答
已经有12人回复
- 【求助/交流】PCR法克隆基因
已经有8人回复
- 【专题】PCR实验技术指南
已经有535人回复
2楼2016-01-12 15:15:56
