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faile18

金虫 (小有名气)

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[求助] 基因克隆PCR检测不出阳性克隆

请高手帮忙解决一下。目前正在进行载体的构建，将载体骨架进行酶切，切胶回收背景。同时克隆出目的片段，连接pGEM-T载体，转化大肠杆菌，PCR检测阳性克隆，如图1，经测序证明结果正确，选择阳性克隆进行酶切，切胶回收目的片段。背景与目的片段连接过夜，转化大肠杆菌，挑单克隆检测，此时PCR检测无法检测出阳性克隆，提取质粒后酶切检测，均为阳性，如图2，选择阳性克隆1转化农杆菌，挑取单克隆检测，此时PCR仍无法检测出阳性，但双酶切结果及单酶切比较验证均证实转化成功。利用与之前完全相同的体系对起始模板、大肠杆菌阳性克隆，以及转化的农杆菌进行PCR，体系仪器与之前完全相同，但是结果所有的PCR均无条带。酶是一个半月之前购买的，检测过没有问题，引物应该也没有问题，后来以为是dNTP的问题，试了实验室所有的dNTP，也可以扩增出来目的片段见图3，但利用相同的体系和程序又扩不出带了见图4，实在是想不出问题到底出在哪里了，急求各位帮忙啊，感激不尽。
PS：所构建的新载体与原始载体只有酶切位点之内有差异，引物经比对与所构建的载体匹配，理论上可以用PCR检测阳性克隆，但始终无法扩增出目的片段。

图4

图1

图2

图3

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