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wy604987664

新虫 (小有名气)

[求助] 克隆连接18-T连接不上 已有2人参与

克隆启动子1530bp,使用克隆引物pcr,然后纯化回收,跑胶没问题。连接PMD18-T,用天根DH5α感受太13小时左右挑单克隆,采用天根普通taq酶,引物用M13进行菌液pcr,没条带(延伸时间2min)。连接转化两次都没条带,是普通酶扩增不出1500的条带?还是什么原因??

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wy604987664

新虫 (小有名气)

pcr用的taq高保真酶末端有A,连接18-T用了1小时多

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2楼2017-07-17 21:37:33
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豆豆君123

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

3楼2017-07-17 22:37:42
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晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-07-17 23:22:19
1、你可以用蓝白斑筛选克隆,另外你用的PCR酶是不是高保真酶,如果是肯定连不上,因为高保真酶扩增出来的片段是平段的,而T载体要求PCR片段末段带A。

2、T载体是TA克隆载体的简称,就是利用载体的T末端和PCR产物的A末段连接而将目的基因克隆到载体中的方法。
及时行乐,人生不留遗憾!
4楼2017-07-17 23:05:27
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伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
首先你要确定到底连接上没有,可以取1微升连接产物,作为模板,用M13通用引物扩增。如果扩增出目的条带,说明就连上了,可能是转化的问题。如果没有,那可能就是连接的原因,可以试一下提高产物浓度,延伸连接时间。 另外pMD18-T是支持蓝白斑筛选的,你可以通过这个筛选白斑。如果都是蓝斑,那就别浪费时间挑斑了。
祝好
对也罢,错也罢;正也罢,逆也罢;通途也好,崎岖无妨……但问,吾心坚否?若坚,纵使歧路,以铁心,贯穿而过,亦为大道!不坚,便是坦途,也难登临绝顶,观险峰
5楼2017-07-18 00:34:21
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