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15653823606

金虫 (小有名气)

Nevergiveup

[求助] 求助：原核表达实验 已有1人参与

这个蛋白根据预测是不可溶蛋白  
质粒构建好。测序。转化到BL21（DE3）中IPTG诱导表达。
IPTG浓度梯度 1uM/ml  0.5uM/ml  0.1uM/ml  0.05uM/ml
温度37度       2、4、6个小时取样    离心上样
结果如图所示
图一顺序    实验  对照  实验  对照   实验  对照   实验  对照   MARKER

图二顺序    实验  对照  实验  对照    marker   实验 对照   实验  对照

我觉得对照蛋白在25k  27K（两个对照蛋白）都挺准确的。应该是实验没问题。

请问：1、实验接下来，需要做些温度梯度吗？比如18度？28度？
          2、为什么脱色的时候，3个小时就脱色只剩marker，但是时间太短，又不能把胶脱无色。是需要增加上样量吗？    （我加了10ul。marker 5ul）
          3、做IPTG诱导时候，所有不同浓度，温度，时间都要设置对照吗？（我目前是这样的，感觉挺麻烦，但是实际觉得对照都一样。）

求助：原核表达实验
IMG_2376.JPG


求助：原核表达实验-1
IMG_2377.JPG
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1楼 2017-03-04 10:27:03
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xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)
直接用1mM吧，预测跟实际表达情况是不太一样的，你要看是可溶性还是包涵体就要超裂分别跑上清跟沉淀来看，确定是包涵体表达再调整温度，一般情况下，只做37度就够了，如果是包涵体表达，实验条件再改变也很难做成可溶性表达。跑胶是一般要做上清跟沉淀两个样品，当然还有你的未诱导的对照。还有，不用取不同时间点来做，4到6小时诱导完做就可以，要不然太浪费时间跟精力，做无用功。

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15653823606
4楼2017-03-04 16:27:18
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15653823606

金虫 (小有名气)

Nevergiveup
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by xinxiyuzhou at 2017-03-04 16:27:18
直接用1mM吧，预测跟实际表达情况是不太一样的，你要看是可溶性还是包涵体就要超裂分别跑上清跟沉淀来看，确定是包涵体表达再调整温度，一般情况下，只做37度就够了，如果是包涵体表达，实验条件再改变也很难做成可 ...

谢谢指导。
我也去请教了师姐。她的建议是换个表达载体。重新做一次。
那我下一步就直接换rosetta然后再37度 1mM 4-6小时诱导。再次跑胶。
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5楼2017-03-04 17:06:35
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金tuotuo

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
15653823606: 金币+30, ★★★很有帮助 2017-03-06 13:45:36
我之前也碰到过类似的问题，对此，说一下我的经验，首先确定一下你在此条件下蛋白是否可溶性表达，按照：未诱导菌体，诱导菌体，诱导后破碎上清，诱导后破碎沉淀的样品顺序，检测一下。如果目的条带在诱导后破碎沉淀中有很多而上清中非常少，基本可判断是形成了包涵体。因此，温度37℃可能过高，IPTG 1mM 可能也过高。IPTG浓度越高蛋虽表达的越快，但不能及时释放到上清，可溶性受阻。所以直接先降低温度到16℃，IPTG浓度降到0.2mM,过夜诱导12h左右。之后再次检测是否可溶，如果还不行的话再换表达载体。
关于第二个问题，首先检查一下你的染色液如果没问题的话，适当延长染色时间，之后脱色液隔十几分钟换一次，直到你觉得OK。
我们的脱色液配方：冰乙酸20ml,甲醇60ml,加水定容至200ml。染色液：考马斯亮蓝染液R250   0.25g,冰乙酸 20ml,甲醇60ml,加水定容至200ml。
关于你的第三个问题那要看你的实验目的是什么了，如果只是要得到可溶性目的蛋白，就没必要做那么多温度对照。希望能够对你有帮助。
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15653823606
8楼2017-03-06 11:46:20
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15653823606

金虫 (小有名气)

Nevergiveup
看别人都是可以直接加到1mM/ml  是不是我的诱导浓度过低？
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2楼2017-03-04 11:08:07
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15653823606

金虫 (小有名气)

Nevergiveup
自己顶下。求大神解答。
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3楼2017-03-04 11:09:31
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prthefu

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 15653823606 at 2017-03-04 17:06:35
谢谢指导。
我也去请教了师姐。她的建议是换个表达载体。重新做一次。
那我下一步就直接换rosetta然后再37度 1mM 4-6小时诱导。再次跑胶。...

楼主，你表达质粒用的是什么啊，还有，你换用rosetta表达感受态之后，诱导表达情况怎么样
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15653823606
nothing is impossible in this world，if you have the will to win，you can achieve anything
6楼2017-03-06 09:58:42
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15653823606

金虫 (小有名气)

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送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by prthefu at 2017-03-06 09:58:42
楼主，你表达质粒用的是什么啊，还有，你换用rosetta表达感受态之后，诱导表达情况怎么样...

质粒是pEASY-Blunt E1     我还在做，看看效果怎么样
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7楼2017-03-06 10:43:26
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15653823606

金虫 (小有名气)

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引用回帖:
8楼: Originally posted by 金tuotuo at 2017-03-06 11:46:20
我之前也碰到过类似的问题，对此，说一下我的经验，首先确定一下你在此条件下蛋白是否可溶性表达，按照：未诱导菌体，诱导菌体，诱导后破碎上清，诱导后破碎沉淀的样品顺序，检测一下。如果目的条带在诱导后破碎沉淀 ...

非常感谢。
我继续尝试一下鉴定是否是可溶表达。
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9楼2017-03-06 13:53:43
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prthefu

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 15653823606 at 2017-03-06 10:43:26
质粒是pEASY-Blunt E1     我还在做，看看效果怎么样...

我现在也是用的pEASY-Blunt E1 表达质粒，感受态选用的是全式金产品Transetta （DE3），但是，现在只是构建好了重组菌，在摸索表达
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10楼2017-03-06 17:09:22
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