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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：原核表达实验
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prthefu

木虫 (著名写手)
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8楼: Originally posted by 金tuotuo at 2017-03-06 11:46:20
我之前也碰到过类似的问题，对此，说一下我的经验，首先确定一下你在此条件下蛋白是否可溶性表达，按照：未诱导菌体，诱导菌体，诱导后破碎上清，诱导后破碎沉淀的样品顺序，检测一下。如果目的条带在诱导后破碎沉淀 ...

想跟你交流一下，诱导表达时，如果空载诱导前后和重组菌诱导前后，各自的上清、沉淀跑SDS-PAGE，发现都没有什么太大区别，是不是说明没有表达出来呢。前提重组菌我已经测序正确了。另一个问题，如果改变诱导条件后，发现目的蛋白在沉淀，不可溶，那就需要换载体吗？为什么呢？
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11楼2017-03-06 17:13:34
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15653823606

金虫 (小有名气)

Nevergiveup
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10楼: Originally posted by prthefu at 2017-03-06 17:09:22
我现在也是用的pEASY-Blunt E1 表达质粒，感受态选用的是全式金产品Transetta （DE3），但是，现在只是构建好了重组菌，在摸索表达...

一样的。我也是用全式金的那些试剂盒。如果有结果可以沟通一下哈。
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12楼2017-03-06 20:07:41
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15653823606

金虫 (小有名气)

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11楼: Originally posted by prthefu at 2017-03-06 17:13:34
想跟你交流一下，诱导表达时，如果空载诱导前后和重组菌诱导前后，各自的上清、沉淀跑SDS-PAGE，发现都没有什么太大区别，是不是说明没有表达出来呢。前提重组菌我已经测序正确了。另一个问题，如果改变诱导条件后 ...

我是用的一个对照片段做的，表达蛋白分子量27KDa.
如果用的全式金那个试剂盒，里面有这个对照片段。
我第一次用的BL21（DE3）做的，显示出来对照条带在27K。但是实验中没有目的条带。
所以我觉得可能是不表达。
你那个如果实验没问题的话，应该也是不表达吧。
至于第二个问题。我这里有个全世金的那个原核表达表达解释的PPT。你看一下吧，应该有收获。
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13楼2017-03-06 20:16:13
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15653823606

金虫 (小有名气)

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11楼: Originally posted by prthefu at 2017-03-06 17:13:34
想跟你交流一下，诱导表达时，如果空载诱导前后和重组菌诱导前后，各自的上清、沉淀跑SDS-PAGE，发现都没有什么太大区别，是不是说明没有表达出来呢。前提重组菌我已经测序正确了。另一个问题，如果改变诱导条件后 ...

这是原核表达的PPT
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  • 附件 1 : 全式金原核表达.pdf
    • 2017-03-06 20:17:50, 2.3 M
14楼2017-03-06 20:18:19
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prthefu

木虫 (著名写手)
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4楼: Originally posted by xinxiyuzhou at 2017-03-04 16:27:18
直接用1mM吧，预测跟实际表达情况是不太一样的，你要看是可溶性还是包涵体就要超裂分别跑上清跟沉淀来看，确定是包涵体表达再调整温度，一般情况下，只做37度就够了，如果是包涵体表达，实验条件再改变也很难做成可 ...

你好，想问一下，我重组菌测序正确做原核表达，可是做了多次，发现重组菌诱导、未诱导和空载组诱导，跑胶电泳条带都没有什么区别，不知道你能不能给我指点指点。谢谢
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15楼2017-03-09 13:23:09
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prthefu

木虫 (著名写手)
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13楼: Originally posted by 15653823606 at 2017-03-06 20:16:13
我是用的一个对照片段做的，表达蛋白分子量27KDa.
如果用的全式金那个试剂盒，里面有这个对照片段。
我第一次用的BL21（DE3）做的，显示出来对照条带在27K。但是实验中没有目的条带。
所以我觉得可能是不表达。 ...

几个对照组条带没有区别是没有表达吗？那，怎么办，明明重组菌测序正确，为什么就没有表达呢
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16楼2017-03-09 13:26:46
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15653823606

金虫 (小有名气)

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16楼: Originally posted by prthefu at 2017-03-09 13:26:46
几个对照组条带没有区别是没有表达吗？那，怎么办，明明重组菌测序正确，为什么就没有表达呢...

我也是刚做。但是同样1个月时间无结果。更换了两种感受态。BL21 。rosetta。尝试过各种温度。各种浓度。
电话咨询过很多技术。死皮赖脸问了好多人。现在觉得可能有以下原因。
1、是否存在信号肽？  通常来说需要去除信号肽。再去诱导。
2、从上游操作中寻找问题？比如说质粒构建。包括启动子等控制元件是否出现问题。
3、是否存在跨膜结构域？几次跨膜。因为这个跨膜蛋白是很难在原核生物中表达，可以尝试去除跨膜域再去诱导。
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17楼2017-03-09 14:54:08
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prthefu

木虫 (著名写手)
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17楼: Originally posted by 15653823606 at 2017-03-09 14:54:08
我也是刚做。但是同样1个月时间无结果。更换了两种感受态。BL21 。rosetta。尝试过各种温度。各种浓度。
电话咨询过很多技术。死皮赖脸问了好多人。现在觉得可能有以下原因。
1、是否存在信号肽？  通常来说需要 ...

我的蛋白有跨膜结构域，是不是这个原因，导致表达不出来
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18楼2017-03-09 15:51:48
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15653823606

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18楼: Originally posted by prthefu at 2017-03-09 15:51:48
我的蛋白有跨膜结构域，是不是这个原因，导致表达不出来...

可能是吧。你可以尝试去除跨膜结构域那几个氨基酸，重建质粒试一下。
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19楼2017-03-09 15:59:55
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prthefu

木虫 (著名写手)
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19楼: Originally posted by 15653823606 at 2017-03-09 15:59:55
可能是吧。你可以尝试去除跨膜结构域那几个氨基酸，重建质粒试一下。...

去掉？那就不说自己的目的蛋白了啊，而且，我的跨膜结构域有六个，先关的氨基酸也不少呢。我的目的蛋白中间有六个跨膜结构，所以，去掉应该不太可能。
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20楼2017-03-09 17:06:29
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