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15653823606金虫 (小有名气)
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求助：原核表达实验已有1人参与
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这个蛋白根据预测是不可溶蛋白 质粒构建好。测序。转化到BL21（DE3）中IPTG诱导表达。 IPTG浓度梯度 1uM/ml 0.5uM/ml 0.1uM/ml 0.05uM/ml 温度37度 2、4、6个小时取样 离心上样 结果如图所示 图一顺序 实验 对照 实验 对照 实验 对照 实验 对照 MARKER 图二顺序 实验 对照 实验 对照 marker 实验 对照 实验 对照 我觉得对照蛋白在25k 27K（两个对照蛋白）都挺准确的。应该是实验没问题。 请问：1、实验接下来，需要做些温度梯度吗？比如18度？28度？ 2、为什么脱色的时候，3个小时就脱色只剩marker，但是时间太短，又不能把胶脱无色。是需要增加上样量吗？ （我加了10ul。marker 5ul） 3、做IPTG诱导时候，所有不同浓度，温度，时间都要设置对照吗？（我目前是这样的，感觉挺麻烦，但是实际觉得对照都一样。）  IMG_2376.JPG  IMG_2377.JPG |
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15653823606: 金币+30, ★★★很有帮助 2017-03-06 13:45:36
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15653823606: 金币+30, ★★★很有帮助 2017-03-06 13:45:36
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我之前也碰到过类似的问题，对此，说一下我的经验，首先确定一下你在此条件下蛋白是否可溶性表达，按照：未诱导菌体，诱导菌体，诱导后破碎上清，诱导后破碎沉淀的样品顺序，检测一下。如果目的条带在诱导后破碎沉淀中有很多而上清中非常少，基本可判断是形成了包涵体。因此，温度37℃可能过高，IPTG 1mM 可能也过高。IPTG浓度越高蛋虽表达的越快，但不能及时释放到上清，可溶性受阻。所以直接先降低温度到16℃，IPTG浓度降到0.2mM,过夜诱导12h左右。之后再次检测是否可溶，如果还不行的话再换表达载体。 关于第二个问题，首先检查一下你的染色液如果没问题的话，适当延长染色时间，之后脱色液隔十几分钟换一次，直到你觉得OK。 我们的脱色液配方：冰乙酸20ml,甲醇60ml,加水定容至200ml。染色液：考马斯亮蓝染液R250 0.25g,冰乙酸 20ml,甲醇60ml,加水定容至200ml。 关于你的第三个问题那要看你的实验目的是什么了，如果只是要得到可溶性目的蛋白，就没必要做那么多温度对照。希望能够对你有帮助。  |
156538236068楼2017-03-06 11:46:20
15653823606
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2楼2017-03-04 11:08:07
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3楼2017-03-04 11:09:31
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直接用1mM吧，预测跟实际表达情况是不太一样的，你要看是可溶性还是包涵体就要超裂分别跑上清跟沉淀来看，确定是包涵体表达再调整温度，一般情况下，只做37度就够了，如果是包涵体表达，实验条件再改变也很难做成可溶性表达。跑胶是一般要做上清跟沉淀两个样品，当然还有你的未诱导的对照。还有，不用取不同时间点来做，4到6小时诱导完做就可以，要不然太浪费时间跟精力，做无用功。 发自小木虫Android客户端 |
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4楼2017-03-04 16:27:18