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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：原核表达实验
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15653823606

金虫 (小有名气)

Nevergiveup

[求助] 求助：原核表达实验已有1人参与

这个蛋白根据预测是不可溶蛋白  
质粒构建好。测序。转化到BL21（DE3）中IPTG诱导表达。
IPTG浓度梯度 1uM/ml  0.5uM/ml  0.1uM/ml  0.05uM/ml
温度37度       2、4、6个小时取样    离心上样
结果如图所示
图一顺序    实验  对照  实验  对照   实验  对照   实验  对照   MARKER

图二顺序    实验  对照  实验  对照    marker   实验 对照   实验  对照

我觉得对照蛋白在25k  27K（两个对照蛋白）都挺准确的。应该是实验没问题。

请问：1、实验接下来，需要做些温度梯度吗？比如18度？28度？
          2、为什么脱色的时候，3个小时就脱色只剩marker，但是时间太短，又不能把胶脱无色。是需要增加上样量吗？    （我加了10ul。marker 5ul）
          3、做IPTG诱导时候，所有不同浓度，温度，时间都要设置对照吗？（我目前是这样的，感觉挺麻烦，但是实际觉得对照都一样。）

求助：原核表达实验
IMG_2376.JPG


求助：原核表达实验-1
IMG_2377.JPG
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1楼2017-03-04 10:27:03
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15653823606

金虫 (小有名气)

Nevergiveup
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by xinxiyuzhou at 2017-03-04 16:27:18
直接用1mM吧，预测跟实际表达情况是不太一样的，你要看是可溶性还是包涵体就要超裂分别跑上清跟沉淀来看，确定是包涵体表达再调整温度，一般情况下，只做37度就够了，如果是包涵体表达，实验条件再改变也很难做成可 ...

谢谢指导。
我也去请教了师姐。她的建议是换个表达载体。重新做一次。
那我下一步就直接换rosetta然后再37度 1mM 4-6小时诱导。再次跑胶。
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5楼2017-03-04 17:06:35
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15653823606

金虫 (小有名气)

Nevergiveup
看别人都是可以直接加到1mM/ml  是不是我的诱导浓度过低？
赞一下 回复此楼
2楼2017-03-04 11:08:07
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15653823606

金虫 (小有名气)

Nevergiveup
自己顶下。求大神解答。
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3楼2017-03-04 11:09:31
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xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)
直接用1mM吧，预测跟实际表达情况是不太一样的，你要看是可溶性还是包涵体就要超裂分别跑上清跟沉淀来看，确定是包涵体表达再调整温度，一般情况下，只做37度就够了，如果是包涵体表达，实验条件再改变也很难做成可溶性表达。跑胶是一般要做上清跟沉淀两个样品，当然还有你的未诱导的对照。还有，不用取不同时间点来做，4到6小时诱导完做就可以，要不然太浪费时间跟精力，做无用功。

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15653823606
4楼2017-03-04 16:27:18
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