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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于诱导表达问题
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新虫 (初入文坛)

[求助] 关于诱导表达问题 已有6人参与

重组菌诱导表达后跑蛋白电泳，结果如下图。从左到右依次为maker、重组菌上清、重组菌沉淀、空菌上清和沉淀
重组载体为bl-21-pet-28a，带his-tag，诱导温度为16度，时间16小时左右
用16度诱导是看别人说低温诱导有助于蛋白的正确折叠，可是我这怎么全是包涵体
希望有人能帮我解惑！！！！！！！！！！！！

关于诱导表达问题
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1楼 2017-02-14 13:10:05
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栾栾silence

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-02-15 07:52:41
并不是所有的原核表达蛋白都会分泌表达的，有的就是会形成包涵体，看到你的上清中其实也含有一点目的蛋白，你可以将菌体多超声，多裂解，使其充分裂解，然后只要上清中的目的蛋白，也可以就这样按照包涵体蛋白的提取方法来做。
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怀挺！
3楼2017-02-14 16:28:56
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栾栾silence

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-02-16 07:48:27
引用回帖:
4楼: Originally posted by 新人求帮助 at 2017-02-14 16:45:35
超声时间过长不是会使蛋白变性吗？这样不会影响酶活性的测定吗...

超声时间过长会产生很多杂蛋白，而且可能会使目的蛋白破碎，所以所有的事情都不可能两全其美的，你可以把超声时间调成超1s，停1s（共15min，超2遍）。如果还是担心变性之类的，还是采用包涵体的方式提纯蛋白吧。
我表达的蛋白也会大多都在沉淀里，如果上清中有一些，我就不管沉淀，就提上清中的蛋白就好了，这样就是比较浪费工作力，我还有师姐直接就把沉淀冻在-20，每次需要蛋白的话就拿出来超一超，我个人认为每次超声时间不长的话是不怎么影响的，但是还是根据自己的蛋白特性，条件都不一样的。
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怀挺！
14楼2017-02-15 17:35:42
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栾栾silence

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 新人求帮助 at 2017-02-14 16:50:53
我们实验室做诱导表达的诱导剂终浓度都是0.2mM，应该不算高吧...

我们实验室普遍使用1mM的IPTG。但是实验室不一样，条件还是有差别的。
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怀挺！
15楼2017-02-15 17:36:42
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栾栾silence

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by seascen2016 at 2017-02-14 19:01:16
IPTG吗？我们实验室用100uM
...

这个。。。比我们配的母液浓度都高，确定是对的?
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怀挺！
16楼2017-02-15 17:37:36
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