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jcstone1027

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[交流] 两位点的定点突变已有3人参与

想突变基因片段上两个相隔比较远的位点，用DPN1法，因为做一个位点扩增出的是带缺刻的质粒，对于另外一个位点无法以此缺刻质粒为模板突变第二处位点，想过用磷酸化的引物，让第一遍形成的缺刻质粒闭合成环，再以此环状质粒为模板突变第二处位点，大家觉得第一步扩出的缺刻质粒闭合成环可以实现吗，有谁这样做过？十分想知道答案，谢谢大家！

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1楼 2016-11-24 18:54:18

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starseacow

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不太明白你的问题是什么
用第一个位点引物做PCR，DPNI去模板，转大肠杆菌扩增提质粒，测序通过后作为模板用另一对引物做第二轮即可。

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2楼2016-11-25 00:29:33

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jcstone1027

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我的意思是第一次扩完重组质粒后，它形成的是带缺刻的质粒，我不想立即做转化测序，而是想拿扩增完的缺刻质粒再扩，把第二处位点也变回来，因为第一遍形成的是缺刻质粒，再用这个模板突变另外一处位点，原理上不能实现，也就是说用带磷酸化的引物扩重组质粒，扩增产物能形成完整的环状质粒吗？我是这个意思，谢谢你的回答

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3楼2016-11-25 12:10:55

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