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jcstone1027铁杆木虫 (正式写手)
木虫
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两位点的定点突变 已有3人参与
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想突变基因片段上两个相隔比较远的位点，用DPN1法，因为做一个位点扩增出的是带缺刻的质粒，对于另外一个位点无法以此缺刻质粒为模板突变第二处位点，想过用磷酸化的引物，让第一遍形成的缺刻质粒闭合成环，再以此环状质粒为模板突变第二处位点，大家觉得第一步扩出的缺刻质粒闭合成环可以实现吗，有谁这样做过？十分想知道答案，谢谢大家！ 发自小木虫IOS客户端 |
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2楼2016-11-25 00:29:33
jcstone1027
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我的意思是第一次扩完重组质粒后，它形成的是带缺刻的质粒，我不想立即做转化测序，而是想拿扩增完的缺刻质粒再扩，把第二处位点也变回来，因为第一遍形成的是缺刻质粒，再用这个模板突变另外一处位点，原理上不能实现，也就是说用带磷酸化的引物扩重组质粒，扩增产物能形成完整的环状质粒吗？我是这个意思，谢谢你的回答 发自小木虫IOS客户端 |
3楼2016-11-25 12:10:55
jiananx
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请教一下缺刻质粒是什么意思呢？我曾经是先突变一个位点，跑胶如果条带清晰，直接消化后，转化再提取，测序筛选突变成功的再进行第二次突变。 发自小木虫IOS客户端 |
4楼2016-11-25 22:51:35
mailmrcai
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这个不太可行吧，没试过，一般都是第一步克隆好，再克隆第二步，也不麻烦多少。其实我觉得如果这样也可以，那还不如直接加四条引物pcr，总会有阳性克隆，可能比例会低点 发自小木虫Android客户端 |
5楼2016-11-25 22:55:56
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