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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆求助，都两个多月了
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luba

新虫 (小有名气)

[交流] 克隆求助，都两个多月了

要做一个克隆，把已经构建好的一个载体(pCDNA4)上的一个基因切下来，换成另一个。而这另一个基因也是从一个载体(pCDNA3.1)上切下来的。用到的双酶切位点是BamHI和SpeI,都是用的TAKARA的，10*Kbuffer,37度。之前因为pCDNA系列载体上都有两个SpeI位点，切下来好多条带，就把pCDNA4做了个定点突变，然后再切，就只有我要的条带了。所以感觉切应该没有问题，因为切下来的条带都能看到。连接也是过夜的。就是不长克隆，还做了单单载体的对照，也没长。一个菌都没有！就有一次，拿错了，还拿了原来没做过突变的pCDNA4来切的，结果还长了，挑了几个克隆，用另一个酶鉴定了下，貌似是连在另一对B-S的位置上了（前面说过，有两个SpeI位点，BamHI位点在这两个中间），不过为了保险也拿去测序了，还不知道结果。。。。
还做过分步酶切，转化时也把量加大了，感受态用过DH5A，也用过JM109,真是什么方法都用过了，实在不晓得原因！很烦！什么事情都没心情了！请大家帮我想想，出出主意！再这样下去我也不好意思再待者了，太打击人了。。。。
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1楼 2012-08-27 21:37:23
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jjg0912

木虫 (正式写手)
换个酶切切
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2楼2012-08-28 05:27:59
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yandz680717

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1949stone: 金币+1, 鼓励 2012-08-28 07:20:50
换连接酶，注意载体和外源片段的摩尔比1:5-1:10
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3楼2012-08-28 06:13:17
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lidonghong

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-30 14:36:51
首先你要保证载体(pCDNA4)和目的基因酶切成功，然后再按照楼上的比例进行连接，连接时的条件可以修改下，不一定要16度过夜，18度 22度连接也是可以的，具体条件看看你的连接酶使用说明书！
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4楼2012-08-28 08:36:00
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
主要问题是你连接不长 做转化的时候有对照么 对照长了么 感受态是买的么 有品质保证么
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5楼2012-08-28 08:50:35
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101202139

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
构建克隆的两个主要点：一个是你的载体处理的要干净，另外你的感受态效率要高。
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6楼2012-08-28 09:39:59
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friends9892

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
连接时间短了虽然不行 但也不用非得过夜，没那个必要，另外 你没有试试载体酶切后脱磷吗
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8楼2012-08-28 10:44:13
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yijunliu

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
估计是感受态的转化效率有些问题，可以用别的实验室的做试试
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10楼2012-08-28 10:57:31
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lecou

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
luba: 金币+1 2012-08-28 21:25:55
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-30 14:37:06
酶切后切胶回收的亮度怎么样，最后连接比例应该在1；10左右，可以多做几个温度的连接，16度4度都试试，然后就是转化效率的问题，我一直也用的DH5a一直都没有问题，再多尝试几次，祝你成功！愚见~
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11楼2012-08-28 11:13:29
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梦婷婷玉丽

木虫 (职业作家)
楼主加油，棒棒的
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12楼2012-08-28 11:18:39
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tanglian8655

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
luba: 金币+1 2012-08-28 21:28:08
有没有用突变后的载体做一个空白对照呢，做两个对照，一个是为突变的空载，一个突变后的空载，试一试结果怎么样
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13楼2012-08-28 13:17:32
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三十不惑

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
luba: 金币+1 2012-08-28 21:27:58
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-30 14:37:19
我有些建议，不一定能解决你的问题，希望能给你一些参考。
试验中可能会碰到很多奇奇怪怪的问题，能找到原因当然最好，很多问题可能并不是由于我们自身问题造成的，一些我们不可控力的存在，让问题的解决变得迷离，排除起来很困难。如果一时半刻找不到原因，何不另辟蹊径？
我说一下我的思路，如果是我要做这个实验碰到这些问题后我会这样做
1、重新寻找合适的PCDNA4和目标基因的酶切位点
2、以酶切位点设计引物（两端保护碱基不可忘）对PCDNA4进行扩增
3、以目的基因（PCDNA3.1上的基因）两端为引物，在其末端添加正确的酶切位点碱基及保护碱基，对目的基因进行扩增
4、双酶切，回收
5、连接
6、转化
我曾经成功的用这种方法解决过类似问题，希望能给楼主一些帮助
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15楼2012-08-28 16:16:30
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luba

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yandz680717 at 2012-08-28 06:13:17
换连接酶，注意载体和外源片段的摩尔比1:5-1:10

那个连接酶应该没问题，用它做别的克隆都做的出来的
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16楼2012-08-28 21:22:32
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luba

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lidonghong at 2012-08-28 08:36:00
首先你要保证载体(pCDNA4)和目的基因酶切成功，然后再按照楼上的比例进行连接，连接时的条件可以修改下，不一定要16度过夜，18度 22度连接也是可以的，具体条件看看你的连接酶使用说明书！

我觉得酶切是成功的，因为都是从载体上切下来的所以能看到另外那半切下来的片段
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17楼2012-08-28 21:23:41
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luba

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by snzydong at 2012-08-28 08:50:35
主要问题是你连接不长 做转化的时候有对照么 对照长了么 感受态是买的么 有品质保证么

感受态是自己做的，之前拿它做过很多克隆了，别人也做过，没问题的
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18楼2012-08-28 21:24:16
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luba

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by friends9892 at 2012-08-28 10:44:13
连接时间短了虽然不行 但也不用非得过夜，没那个必要，另外 你没有试试载体酶切后脱磷吗

没做过，实验室没买那个试剂
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19楼2012-08-28 21:24:53
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luba

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by lecou at 2012-08-28 11:13:29
酶切后切胶回收的亮度怎么样，最后连接比例应该在1；10左右，可以多做几个温度的连接，16度4度都试试，然后就是转化效率的问题，我一直也用的DH5a一直都没有问题，再多尝试几次，祝你成功！愚见~

谢谢，亮度不太高，所以我转化时加大了量。。。
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20楼2012-08-28 21:25:38
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luba

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 梦婷婷玉丽 at 2012-08-28 11:18:39
楼主加油，棒棒的

谢谢！
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21楼2012-08-28 21:26:03
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luba

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 三十不惑 at 2012-08-28 16:16:30
我有些建议，不一定能解决你的问题，希望能给你一些参考。
试验中可能会碰到很多奇奇怪怪的问题，能找到原因当然最好，很多问题可能并不是由于我们自身问题造成的，一些我们不可控力的存在，让问题的解决变得迷离， ...

谢谢，只不过我之所以要用那个位点是因为要用之前连在那个基因后的一个荧光标签，所以只能是那两个位点，把那个基因换成我现在要用的
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22楼2012-08-28 21:27:55
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
换酶，或者找个同学帮你重新做一遍，有时候真是几率的事情
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25楼2012-08-29 15:44:29
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zhaowei3563

木虫 (职业作家)
祝福 祝福 祝福 祝福 祝福 祝福 祝福 祝福 祝福 祝福 祝福的场面必须壮观啊
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27楼2012-08-29 16:19:06
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三十不惑

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-30 14:37:41
luba: 金币+2 2012-08-30 22:23:35
引用回帖:
22楼: Originally posted by luba at 2012-08-28 21:27:55
谢谢，只不过我之所以要用那个位点是因为要用之前连在那个基因后的一个荧光标签，所以只能是那两个位点，把那个基因换成我现在要用的...

这个无所谓啊 你完全可以把这两个酶切位点通过PCR的方式换成其他的，或者都不换还是用这两个，一点都不会影响其他。
使用PCR扩增方法的好处是能得到大量而且很纯的线状载体及目的片段，对于后面的实验从质及量上给予保证。当然PCR反应必须要使用高保真酶。

[ Last edited by 三十不惑 on 2012-8-29 at 19:57 ]
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28楼2012-08-29 19:49:10
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木小默

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
双酶切的时间要把握好   要不然切不下来   还有就是在加酶的时候  不要把枪头伸进去  最好贴着液面
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29楼2012-08-29 20:51:40
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王礼鹏

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
会不会你定点突变之后载体的抗性消失了呀！换个感受态转化效率高的试试。。。。祝实验顺利
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30楼2012-08-30 09:50:02
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luba

新虫 (小有名气)
引用回帖:
30楼: Originally posted by 王礼鹏 at 2012-08-30 09:50:02
会不会你定点突变之后载体的抗性消失了呀！换个感受态转化效率高的试试。。。。祝实验顺利

不会的，我做突变的时候最后也是要转化的呀。
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31楼2012-08-30 22:21:21
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luba

新虫 (小有名气)
引用回帖:
29楼: Originally posted by 木小默 at 2012-08-29 20:51:40
双酶切的时间要把握好   要不然切不下来   还有就是在加酶的时候  不要把枪头伸进去  最好贴着液面

我奇怪的就是酶切应该是好的，因为我的载体上有300多bp切下来的片段，插入片段也是从一个载体上切下来的，所以跑胶时都看到那另一部分切下来的片段的，应该是切好了的呀。。。
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32楼2012-08-30 22:22:45
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bioyujun

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
非得用这两个酶切位点吗？或者自己设计引物加酶切位点p下

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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33楼2012-08-30 22:42:59
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hutenghsw7楼
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