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luba

新虫 (小有名气)


[交流] 克隆求助,都两个多月了

要做一个克隆,把已经构建好的一个载体(pCDNA4)上的一个基因切下来,换成另一个。而这另一个基因也是从一个载体(pCDNA3.1)上切下来的。用到的双酶切位点是BamHI和SpeI,都是用的TAKARA的,10*Kbuffer,37度。之前因为pCDNA系列载体上都有两个SpeI位点,切下来好多条带,就把pCDNA4做了个定点突变,然后再切,就只有我要的条带了。所以感觉切应该没有问题,因为切下来的条带都能看到。连接也是过夜的。就是不长克隆,还做了单单载体的对照,也没长。一个菌都没有!就有一次,拿错了,还拿了原来没做过突变的pCDNA4来切的,结果还长了,挑了几个克隆,用另一个酶鉴定了下,貌似是连在另一对B-S的位置上了(前面说过,有两个SpeI位点,BamHI位点在这两个中间),不过为了保险也拿去测序了,还不知道结果。。。。
还做过分步酶切,转化时也把量加大了,感受态用过DH5A,也用过JM109,真是什么方法都用过了,实在不晓得原因!很烦!什么事情都没心情了!请大家帮我想想,出出主意!再这样下去我也不好意思再待者了,太打击人了。。。。
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luba

新虫 (小有名气)


引用回帖:
4楼: Originally posted by lidonghong at 2012-08-28 08:36:00
首先你要保证载体(pCDNA4)和目的基因酶切成功,然后再按照楼上的比例进行连接,连接时的条件可以修改下,不一定要16度过夜,18度 22度连接也是可以的,具体条件看看你的连接酶使用说明书!

我觉得酶切是成功的,因为都是从载体上切下来的所以能看到另外那半切下来的片段
17楼2012-08-28 21:23:41
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yandz680717

木虫 (正式写手)


★ ★
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1949stone: 金币+1, 鼓励 2012-08-28 07:20:50
换连接酶,注意载体和外源片段的摩尔比1:5-1:10
3楼2012-08-28 06:13:17
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lidonghong

金虫 (正式写手)


★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-30 14:36:51
首先你要保证载体(pCDNA4)和目的基因酶切成功,然后再按照楼上的比例进行连接,连接时的条件可以修改下,不一定要16度过夜,18度 22度连接也是可以的,具体条件看看你的连接酶使用说明书!
4楼2012-08-28 08:36:00
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
主要问题是你连接不长 做转化的时候有对照么 对照长了么 感受态是买的么 有品质保证么
5楼2012-08-28 08:50:35
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