应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆求助，都两个多月了
51/1返回列表
查看: 2220  |  回复: 33
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

luba

新虫 (小有名气)

[交流] 克隆求助，都两个多月了

要做一个克隆，把已经构建好的一个载体(pCDNA4)上的一个基因切下来，换成另一个。而这另一个基因也是从一个载体(pCDNA3.1)上切下来的。用到的双酶切位点是BamHI和SpeI,都是用的TAKARA的，10*Kbuffer,37度。之前因为pCDNA系列载体上都有两个SpeI位点，切下来好多条带，就把pCDNA4做了个定点突变，然后再切，就只有我要的条带了。所以感觉切应该没有问题，因为切下来的条带都能看到。连接也是过夜的。就是不长克隆，还做了单单载体的对照，也没长。一个菌都没有！就有一次，拿错了，还拿了原来没做过突变的pCDNA4来切的，结果还长了，挑了几个克隆，用另一个酶鉴定了下，貌似是连在另一对B-S的位置上了（前面说过，有两个SpeI位点，BamHI位点在这两个中间），不过为了保险也拿去测序了，还不知道结果。。。。
还做过分步酶切，转化时也把量加大了，感受态用过DH5A，也用过JM109,真是什么方法都用过了，实在不晓得原因！很烦！什么事情都没心情了！请大家帮我想想，出出主意！再这样下去我也不好意思再待者了，太打击人了。。。。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2012-08-27 21:37:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bioyujun

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
非得用这两个酶切位点吗？或者自己设计引物加酶切位点p下

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
33楼2012-08-30 22:42:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 34 个回答

yandz680717

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1949stone: 金币+1, 鼓励 2012-08-28 07:20:50
换连接酶，注意载体和外源片段的摩尔比1:5-1:10
赞一下 回复此楼
3楼2012-08-28 06:13:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lidonghong

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-30 14:36:51
首先你要保证载体(pCDNA4)和目的基因酶切成功，然后再按照楼上的比例进行连接，连接时的条件可以修改下，不一定要16度过夜，18度 22度连接也是可以的，具体条件看看你的连接酶使用说明书！
赞一下 回复此楼
4楼2012-08-28 08:36:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
主要问题是你连接不长 做转化的时候有对照么 对照长了么 感受态是买的么 有品质保证么
赞一下 回复此楼
5楼2012-08-28 08:50:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 34 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭