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luba

新虫 (小有名气)

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[交流] 克隆求助，都两个多月了

要做一个克隆，把已经构建好的一个载体(pCDNA4)上的一个基因切下来，换成另一个。而这另一个基因也是从一个载体(pCDNA3.1)上切下来的。用到的双酶切位点是BamHI和SpeI,都是用的TAKARA的，10*Kbuffer,37度。之前因为pCDNA系列载体上都有两个SpeI位点，切下来好多条带，就把pCDNA4做了个定点突变，然后再切，就只有我要的条带了。所以感觉切应该没有问题，因为切下来的条带都能看到。连接也是过夜的。就是不长克隆，还做了单单载体的对照，也没长。一个菌都没有！就有一次，拿错了，还拿了原来没做过突变的pCDNA4来切的，结果还长了，挑了几个克隆，用另一个酶鉴定了下，貌似是连在另一对B-S的位置上了（前面说过，有两个SpeI位点，BamHI位点在这两个中间），不过为了保险也拿去测序了，还不知道结果。。。。
还做过分步酶切，转化时也把量加大了，感受态用过DH5A，也用过JM109,真是什么方法都用过了，实在不晓得原因！很烦！什么事情都没心情了！请大家帮我想想，出出主意！再这样下去我也不好意思再待者了，太打击人了。。。。

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1楼 2012-08-27 21:37:23

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luba

新虫 (小有名气)

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引用回帖:

15楼: Originally posted by 三十不惑 at 2012-08-28 16:16:30
我有些建议，不一定能解决你的问题，希望能给你一些参考。
试验中可能会碰到很多奇奇怪怪的问题，能找到原因当然最好，很多问题可能并不是由于我们自身问题造成的，一些我们不可控力的存在，让问题的解决变得迷离， ...

谢谢，只不过我之所以要用那个位点是因为要用之前连在那个基因后的一个荧光标签，所以只能是那两个位点，把那个基因换成我现在要用的