| 查看: 2443 | 回复: 33 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
克隆求助，都两个多月了
|
|||
|
要做一个克隆，把已经构建好的一个载体(pCDNA4)上的一个基因切下来，换成另一个。而这另一个基因也是从一个载体(pCDNA3.1)上切下来的。用到的双酶切位点是BamHI和SpeI,都是用的TAKARA的，10*Kbuffer,37度。之前因为pCDNA系列载体上都有两个SpeI位点，切下来好多条带，就把pCDNA4做了个定点突变，然后再切，就只有我要的条带了。所以感觉切应该没有问题，因为切下来的条带都能看到。连接也是过夜的。就是不长克隆，还做了单单载体的对照，也没长。一个菌都没有！就有一次，拿错了，还拿了原来没做过突变的pCDNA4来切的，结果还长了，挑了几个克隆，用另一个酶鉴定了下，貌似是连在另一对B-S的位置上了（前面说过，有两个SpeI位点，BamHI位点在这两个中间），不过为了保险也拿去测序了，还不知道结果。。。。 还做过分步酶切，转化时也把量加大了，感受态用过DH5A，也用过JM109,真是什么方法都用过了，实在不晓得原因！很烦！什么事情都没心情了！请大家帮我想想，出出主意！再这样下去我也不好意思再待者了，太打击人了。。。。 |
回复此楼» 猜你喜欢
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有244人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有15人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 审稿已经两个多月了，能否催稿问一下呢？纠结
已经有17人回复
- 一篇英文文章投出去两个多月了，没有消息，要不要催？
已经有20人回复
- 已经Under review两个多月了，怎么回事啊？？
已经有19人回复
- 投了 RSC advances 两个多月了，还在审稿 正常吗？
已经有32人回复
- 等了两个多月，竟然退稿，原因却是如此？
已经有15人回复
- Physica E 审稿两个多月，要不要催稿？
已经有4人回复
- 【求助/交流】急！克隆快做了一个月了，就是做不出来
已经有24人回复
- 投稿三个多月，求助
已经有9人回复
- 【问题求助】怀孕两个月补叶酸还来得及吗？
已经有41人回复
- 【求助/交流】求助关于载体多克隆位点改造
已经有8人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
94年女征男友
+1/270
-
福建师范大学叶应祥课题组招收2026级博士研究生
+2/124
-
求助紫外可见分光光度计
+1/99
-
招收材料与化学相关专业硕士研究生
+1/80
-
广东工业大学-木质纤维素高值化利用团队招博士研究生
+1/80
-
浙江大学侯阳教授团队诚聘博士后---高性能固态电解质与固态电池器件设计
+1/76
-
中飞院航空锂电池团队接受硕士生调剂
+1/74
-
国家双一流高校-国家级青年人才课题组博士招生
+2/64
-
江苏科技大学能源材料化学课题组郭兴梅教授招收博士研究生1-2名
+1/40
-
沈阳农业大学生物与医药专硕招收调剂生！！！！！！！！！！
+1/37
-
欢迎08开头或部分07开头的有缘人报考
+1/34
-
招收材料、化学类调剂生，专硕学硕均可
+1/33
-
哈尔滨工业大学（深圳）-何自开教授团队诚招化学工程与技术专业博士研究生
+1/30
-
天津理工大学国家杰青王铁团队招聘
+1/29
-
福建师范大学国家级人才团队招收2026年博士研究生
+1/6
-
哈尔滨工业大学(深圳)国家级青年人才机械工程、热能与能源等专业26年入学博士招生
+1/5
-
温州大学化材学院王娟课题组招生
+1/4
-
宁波东方理工大学余鹏课题组2026年上海交大联培博士生、博士后、科研助理招聘
+1/3
-
【博士招生】天津理工大学国家杰青王铁课题组招收2026年博士研究生
+1/3
-
福建师范大学环境与资源学院招收2026级硕士生
+1/1
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
luba: 金币+1 2012-08-28 21:27:58
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-30 14:37:19
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
luba: 金币+1 2012-08-28 21:27:58
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-30 14:37:19
|
我有些建议，不一定能解决你的问题，希望能给你一些参考。 试验中可能会碰到很多奇奇怪怪的问题，能找到原因当然最好，很多问题可能并不是由于我们自身问题造成的，一些我们不可控力的存在，让问题的解决变得迷离，排除起来很困难。如果一时半刻找不到原因，何不另辟蹊径？ 我说一下我的思路，如果是我要做这个实验碰到这些问题后我会这样做 1、重新寻找合适的PCDNA4和目标基因的酶切位点 2、以酶切位点设计引物（两端保护碱基不可忘）对PCDNA4进行扩增 3、以目的基因（PCDNA3.1上的基因）两端为引物，在其末端添加正确的酶切位点碱基及保护碱基，对目的基因进行扩增 4、双酶切，回收 5、连接 6、转化 我曾经成功的用这种方法解决过类似问题，希望能给楼主一些帮助 |
15楼2012-08-28 16:16:30
3楼2012-08-28 06:13:17
4楼2012-08-28 08:36:00
5楼2012-08-28 08:50:35
