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克隆求助,都两个多月了
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要做一个克隆,把已经构建好的一个载体(pCDNA4)上的一个基因切下来,换成另一个。而这另一个基因也是从一个载体(pCDNA3.1)上切下来的。用到的双酶切位点是BamHI和SpeI,都是用的TAKARA的,10*Kbuffer,37度。之前因为pCDNA系列载体上都有两个SpeI位点,切下来好多条带,就把pCDNA4做了个定点突变,然后再切,就只有我要的条带了。所以感觉切应该没有问题,因为切下来的条带都能看到。连接也是过夜的。就是不长克隆,还做了单单载体的对照,也没长。一个菌都没有!就有一次,拿错了,还拿了原来没做过突变的pCDNA4来切的,结果还长了,挑了几个克隆,用另一个酶鉴定了下,貌似是连在另一对B-S的位置上了(前面说过,有两个SpeI位点,BamHI位点在这两个中间),不过为了保险也拿去测序了,还不知道结果。。。。 还做过分步酶切,转化时也把量加大了,感受态用过DH5A,也用过JM109,真是什么方法都用过了,实在不晓得原因!很烦!什么事情都没心情了!请大家帮我想想,出出主意!再这样下去我也不好意思再待者了,太打击人了。。。。 |
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
luba: 金币+1 2012-08-28 21:27:58
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-30 14:37:19
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-30 14:37:19
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我有些建议,不一定能解决你的问题,希望能给你一些参考。 试验中可能会碰到很多奇奇怪怪的问题,能找到原因当然最好,很多问题可能并不是由于我们自身问题造成的,一些我们不可控力的存在,让问题的解决变得迷离,排除起来很困难。如果一时半刻找不到原因,何不另辟蹊径? 我说一下我的思路,如果是我要做这个实验碰到这些问题后我会这样做 1、重新寻找合适的PCDNA4和目标基因的酶切位点 2、以酶切位点设计引物(两端保护碱基不可忘)对PCDNA4进行扩增 3、以目的基因(PCDNA3.1上的基因)两端为引物,在其末端添加正确的酶切位点碱基及保护碱基,对目的基因进行扩增 4、双酶切,回收 5、连接 6、转化 我曾经成功的用这种方法解决过类似问题,希望能给楼主一些帮助 |
15楼2012-08-28 16:16:30
3楼2012-08-28 06:13:17
4楼2012-08-28 08:36:00
5楼2012-08-28 08:50:35










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