| 查看: 2906 | 回复: 33 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
克隆求助，都两个多月了
|
|||
|
要做一个克隆，把已经构建好的一个载体(pCDNA4)上的一个基因切下来，换成另一个。而这另一个基因也是从一个载体(pCDNA3.1)上切下来的。用到的双酶切位点是BamHI和SpeI,都是用的TAKARA的，10*Kbuffer,37度。之前因为pCDNA系列载体上都有两个SpeI位点，切下来好多条带，就把pCDNA4做了个定点突变，然后再切，就只有我要的条带了。所以感觉切应该没有问题，因为切下来的条带都能看到。连接也是过夜的。就是不长克隆，还做了单单载体的对照，也没长。一个菌都没有！就有一次，拿错了，还拿了原来没做过突变的pCDNA4来切的，结果还长了，挑了几个克隆，用另一个酶鉴定了下，貌似是连在另一对B-S的位置上了（前面说过，有两个SpeI位点，BamHI位点在这两个中间），不过为了保险也拿去测序了，还不知道结果。。。。 还做过分步酶切，转化时也把量加大了，感受态用过DH5A，也用过JM109,真是什么方法都用过了，实在不晓得原因！很烦！什么事情都没心情了！请大家帮我想想，出出主意！再这样下去我也不好意思再待者了，太打击人了。。。。 |
回复此楼» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有225人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 审稿已经两个多月了，能否催稿问一下呢？纠结
已经有17人回复
- 一篇英文文章投出去两个多月了，没有消息，要不要催？
已经有20人回复
- 已经Under review两个多月了，怎么回事啊？？
已经有19人回复
- 投了 RSC advances 两个多月了，还在审稿 正常吗？
已经有32人回复
- 等了两个多月，竟然退稿，原因却是如此？
已经有15人回复
- Physica E 审稿两个多月，要不要催稿？
已经有4人回复
- 【求助/交流】急！克隆快做了一个月了，就是做不出来
已经有24人回复
- 投稿三个多月，求助
已经有9人回复
- 【问题求助】怀孕两个月补叶酸还来得及吗？
已经有41人回复
- 【求助/交流】求助关于载体多克隆位点改造
已经有8人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
祈福
+5/470
-
发榜前的“心理过山车”：你经历了吗？
+5/210
-
威格科技：为化学合成打造全流程惰性气氛解决方案
+1/88
-
3-羟基丙腈（CAS：109-78-4）
+1/86
-
1,2-双(三甲基硅氧基)乙烷（CAS：7381-30-8 ）
+1/85
-
丁烯二醇（CAS: 497-06-3）
+1/84
-
中国科学技术大学-苏州国家实验室联培招生-本科直博/硕博连读/申请考核三种方式
+1/79
-
具身智能机器人公司招聘硬件工程师岗位 预算100万内
+1/78
-
【坐标北京，诚征男友，结婚对象】
+5/62
-
广东医科大学博士后招聘-基础医学，生信等方向
+1/48
-
2027 Chemical Engineering Ph.D 招生
+1/39
-
天津大学环境学院童银栋教授招收博士后（生源要素循环/温室效应/新污染物方向）
+1/35
-
哈尔滨工业大学郑州高等研究院查正宝研究员招收博士/硕士
+1/29
-
哈工大（深圳）何自开团队诚招化学工程与技术专业博士生
+1/25
-
一边期待，一边忐忑：发榜前的科研人正在想什么？
+5/20
-
浙江大学医学院附属第一医院招聘科研助理
+1/12
-
有合作举办scopus会议的吗？
+1/5
-
北京理工大学-集成电路与电子学院杰青团队-招博士后
+1/4
-
体外转录 / PCR 总提不上产量？终于找到稳定好用的无机焦磷酸酶
+1/3
-
北理工集成电路杰青团队 | 诚招科助理
+1/2
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
luba: 金币+1 2012-08-28 21:27:58
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-30 14:37:19
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
luba: 金币+1 2012-08-28 21:27:58
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-30 14:37:19
|
我有些建议，不一定能解决你的问题，希望能给你一些参考。 试验中可能会碰到很多奇奇怪怪的问题，能找到原因当然最好，很多问题可能并不是由于我们自身问题造成的，一些我们不可控力的存在，让问题的解决变得迷离，排除起来很困难。如果一时半刻找不到原因，何不另辟蹊径？ 我说一下我的思路，如果是我要做这个实验碰到这些问题后我会这样做 1、重新寻找合适的PCDNA4和目标基因的酶切位点 2、以酶切位点设计引物（两端保护碱基不可忘）对PCDNA4进行扩增 3、以目的基因（PCDNA3.1上的基因）两端为引物，在其末端添加正确的酶切位点碱基及保护碱基，对目的基因进行扩增 4、双酶切，回收 5、连接 6、转化 我曾经成功的用这种方法解决过类似问题，希望能给楼主一些帮助 |
15楼2012-08-28 16:16:30
3楼2012-08-28 06:13:17
4楼2012-08-28 08:36:00
5楼2012-08-28 08:50:35
