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luba

新虫 (小有名气)

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[交流] 克隆求助，都两个多月了

要做一个克隆，把已经构建好的一个载体(pCDNA4)上的一个基因切下来，换成另一个。而这另一个基因也是从一个载体(pCDNA3.1)上切下来的。用到的双酶切位点是BamHI和SpeI,都是用的TAKARA的，10*Kbuffer,37度。之前因为pCDNA系列载体上都有两个SpeI位点，切下来好多条带，就把pCDNA4做了个定点突变，然后再切，就只有我要的条带了。所以感觉切应该没有问题，因为切下来的条带都能看到。连接也是过夜的。就是不长克隆，还做了单单载体的对照，也没长。一个菌都没有！就有一次，拿错了，还拿了原来没做过突变的pCDNA4来切的，结果还长了，挑了几个克隆，用另一个酶鉴定了下，貌似是连在另一对B-S的位置上了（前面说过，有两个SpeI位点，BamHI位点在这两个中间），不过为了保险也拿去测序了，还不知道结果。。。。
还做过分步酶切，转化时也把量加大了，感受态用过DH5A，也用过JM109,真是什么方法都用过了，实在不晓得原因！很烦！什么事情都没心情了！请大家帮我想想，出出主意！再这样下去我也不好意思再待者了，太打击人了。。。。

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1楼 2012-08-27 21:37:23

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三十不惑

铜虫 (小有名气)

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★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
luba: 金币+1 2012-08-28 21:27:58
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-30 14:37:19

我有些建议，不一定能解决你的问题，希望能给你一些参考。
试验中可能会碰到很多奇奇怪怪的问题，能找到原因当然最好，很多问题可能并不是由于我们自身问题造成的，一些我们不可控力的存在，让问题的解决变得迷离，排除起来很困难。如果一时半刻找不到原因，何不另辟蹊径？
我说一下我的思路，如果是我要做这个实验碰到这些问题后我会这样做
1、重新寻找合适的PCDNA4和目标基因的酶切位点
2、以酶切位点设计引物（两端保护碱基不可忘）对PCDNA4进行扩增
3、以目的基因（PCDNA3.1上的基因）两端为引物，在其末端添加正确的酶切位点碱基及保护碱基，对目的基因进行扩增
4、双酶切，回收
5、连接
6、转化
我曾经成功的用这种方法解决过类似问题，希望能给楼主一些帮助