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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆求助，都两个多月了
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luba

新虫 (小有名气)

[交流] 克隆求助，都两个多月了

要做一个克隆，把已经构建好的一个载体(pCDNA4)上的一个基因切下来，换成另一个。而这另一个基因也是从一个载体(pCDNA3.1)上切下来的。用到的双酶切位点是BamHI和SpeI,都是用的TAKARA的，10*Kbuffer,37度。之前因为pCDNA系列载体上都有两个SpeI位点，切下来好多条带，就把pCDNA4做了个定点突变，然后再切，就只有我要的条带了。所以感觉切应该没有问题，因为切下来的条带都能看到。连接也是过夜的。就是不长克隆，还做了单单载体的对照，也没长。一个菌都没有！就有一次，拿错了，还拿了原来没做过突变的pCDNA4来切的，结果还长了，挑了几个克隆，用另一个酶鉴定了下，貌似是连在另一对B-S的位置上了（前面说过，有两个SpeI位点，BamHI位点在这两个中间），不过为了保险也拿去测序了，还不知道结果。。。。
还做过分步酶切，转化时也把量加大了，感受态用过DH5A，也用过JM109,真是什么方法都用过了，实在不晓得原因！很烦！什么事情都没心情了！请大家帮我想想，出出主意！再这样下去我也不好意思再待者了，太打击人了。。。。
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1楼 2012-08-27 21:37:23
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三十不惑

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-30 14:37:41
luba: 金币+2 2012-08-30 22:23:35
引用回帖:
22楼: Originally posted by luba at 2012-08-28 21:27:55
谢谢，只不过我之所以要用那个位点是因为要用之前连在那个基因后的一个荧光标签，所以只能是那两个位点，把那个基因换成我现在要用的...

这个无所谓啊 你完全可以把这两个酶切位点通过PCR的方式换成其他的，或者都不换还是用这两个，一点都不会影响其他。
使用PCR扩增方法的好处是能得到大量而且很纯的线状载体及目的片段，对于后面的实验从质及量上给予保证。当然PCR反应必须要使用高保真酶。

[ Last edited by 三十不惑 on 2012-8-29 at 19:57 ]
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28楼2012-08-29 19:49:10
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yandz680717

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1949stone: 金币+1, 鼓励 2012-08-28 07:20:50
换连接酶，注意载体和外源片段的摩尔比1:5-1:10
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3楼2012-08-28 06:13:17
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lidonghong

金虫 (正式写手)
★ ★
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-30 14:36:51
首先你要保证载体(pCDNA4)和目的基因酶切成功，然后再按照楼上的比例进行连接，连接时的条件可以修改下，不一定要16度过夜，18度 22度连接也是可以的，具体条件看看你的连接酶使用说明书！
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4楼2012-08-28 08:36:00
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
主要问题是你连接不长 做转化的时候有对照么 对照长了么 感受态是买的么 有品质保证么
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5楼2012-08-28 08:50:35
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