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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆求助，都两个多月了
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luba

新虫 (小有名气)

[交流] 克隆求助，都两个多月了

要做一个克隆，把已经构建好的一个载体(pCDNA4)上的一个基因切下来，换成另一个。而这另一个基因也是从一个载体(pCDNA3.1)上切下来的。用到的双酶切位点是BamHI和SpeI,都是用的TAKARA的，10*Kbuffer,37度。之前因为pCDNA系列载体上都有两个SpeI位点，切下来好多条带，就把pCDNA4做了个定点突变，然后再切，就只有我要的条带了。所以感觉切应该没有问题，因为切下来的条带都能看到。连接也是过夜的。就是不长克隆，还做了单单载体的对照，也没长。一个菌都没有！就有一次，拿错了，还拿了原来没做过突变的pCDNA4来切的，结果还长了，挑了几个克隆，用另一个酶鉴定了下，貌似是连在另一对B-S的位置上了（前面说过，有两个SpeI位点，BamHI位点在这两个中间），不过为了保险也拿去测序了，还不知道结果。。。。
还做过分步酶切，转化时也把量加大了，感受态用过DH5A，也用过JM109,真是什么方法都用过了，实在不晓得原因！很烦！什么事情都没心情了！请大家帮我想想，出出主意！再这样下去我也不好意思再待者了，太打击人了。。。。
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1楼 2012-08-27 21:37:23
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luba

新虫 (小有名气)
引用回帖:
29楼: Originally posted by 木小默 at 2012-08-29 20:51:40
双酶切的时间要把握好   要不然切不下来   还有就是在加酶的时候  不要把枪头伸进去  最好贴着液面

我奇怪的就是酶切应该是好的，因为我的载体上有300多bp切下来的片段，插入片段也是从一个载体上切下来的，所以跑胶时都看到那另一部分切下来的片段的，应该是切好了的呀。。。
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32楼2012-08-30 22:22:45
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yandz680717

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1949stone: 金币+1, 鼓励 2012-08-28 07:20:50
换连接酶，注意载体和外源片段的摩尔比1:5-1:10
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3楼2012-08-28 06:13:17
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lidonghong

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-30 14:36:51
首先你要保证载体(pCDNA4)和目的基因酶切成功，然后再按照楼上的比例进行连接，连接时的条件可以修改下，不一定要16度过夜，18度 22度连接也是可以的，具体条件看看你的连接酶使用说明书！
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4楼2012-08-28 08:36:00
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
主要问题是你连接不长 做转化的时候有对照么 对照长了么 感受态是买的么 有品质保证么
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5楼2012-08-28 08:50:35
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