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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » elisa显色问题
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lll940219

新虫 (初入文坛)

[求助] elisa显色问题 已有2人参与

刚刚开始接触生物这方面，想请教各位大神几个基础的问题
1. 酶标抗体如果没与抗原结合，加入底物后会发生显色吗？如果会的话，得到的结果不是不准确了？

2. 待测抗原与固定抗体结合后进行洗涤，未结合的抗原被洗掉不会使原本样品中的抗原量降低吗？

新人感到很迷茫，希望有有人能回复下，跪谢！
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1楼 2016-10-19 00:17:07
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wuhu0612331

铜虫 (正式写手)
问题1,单独酶标抗体就可以与底物反应，问题2再测抗原浓度时有一个饱和浓度，如果从高到底稀释，起初的od值没什么变化

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2楼2016-10-19 04:24:54
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lll940219

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wuhu0612331 at 2016-10-19 04:24:54
问题1,单独酶标抗体就可以与底物反应，问题2再测抗原浓度时有一个饱和浓度，如果从高到底稀释，起初的od值没什么变化

再请教一下问题一~如果直接可以反应，那不是即使酶标抗体没有与抗原结合也同样会显色，这样怎么确定抗原的量呢？
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3楼2016-10-19 09:30:29
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wuhu0612331

铜虫 (正式写手)
那你包被的就是抗原喽，所以首先要做一个抗原包被的梯度出来。选择一个最合适的包被浓度。

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4楼2016-10-19 23:20:45
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biotech_zhou

木虫 (著名写手)

待人以诚：专业/专注/专心

【答案】应助回帖

建议先读懂原理和实验步骤，你加显色液之前还要洗板子，没有结合的酶标抗体会被洗掉；至于抗原量太大，可以先稀释后再进行测定，事先做预实验~~~
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年末优惠荧光定量pcr、WB、ELISA技术服务一律六折！交流锤炼知识，用心构筑桥梁，以更优质的产品及技术服务助力科研；QQ：2513165427；Email：b
5楼2016-12-22 14:10:42
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yyy0305

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

楼主应该是在用双抗夹心法检测抗原，抗体1包被，和抗原反应，然后加酶标抗体反应，最后显色。

问题1：你说的这种情况是存在的，出现这种情况的原因是酶联抗体直接非特异吸附在酶标板条表面了，或者和包被抗体反应的。关于非特异吸附的问题，具体的情况楼主需要进行单一变量空包对照分析。即按照ELISA的流程，分别把其中反应的一个试剂用稀释液代替，看是否有非特异吸附。如空白，抗原，酶联抗体，显色液；包被抗体，空白,酶联抗体，显色液；包被抗体，抗原,空白，显色液。确认是否信号为非特异性的。

问题2：未结合的抗原被洗掉这个绝对有放入，这也是ELISA定量时要有对照品，制作标准曲线的原因。因为对照品中相同浓度下的抗原中结合的抗原也会被洗掉，具有相同的反应过程，所以不会对定量产生影响。

关于ELISA，建议你多看看文献，如中国药典2015版9012等，知道ELISA定量是否准确的标准
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6楼2016-12-22 16:36:15
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